Віруси. Структура. Культивування. Класифікація.
Особливості лабораторної діагностики вірусних захворювань.
Віруси (Від лат. virus — отрута) — неклітинні форми живих організмів[1] , які складаються з нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) і білкової оболонки, зрідка включаючи інші компоненти (ферменти, ліпідні оболонки тощо). Віруси займають екологічну нішу облігатних внутрішньоклітинних паразитів, розмножуючись тільки в живих клітинах, вони використовують їхній ферментативний апарат і переключають клітину на синтез зрілих вірусних часток — віріонів. Поширені всюди. Викликають хвороби рослин, тварин і людини. Існує декілька механізмів антивірусного захисту організму людини. Один із них — синтез інтерферону, протеїну, що бере участь в блокуванні розповсюдження вірусної інфекції між сусідніми клітинами.
У процесі вивчення природи вірусів, після відкриття їх Дмитром Івановським (1892) формувалися уявлення про віруси як про дрібні організми. Епітет «фільтрівний» згодом був відкинутий, тому що стали відомі фільтрівні форми або стадії звичайних бактерій, а потім і фільтрівні види бактерій. Найправдоподібнішою є гіпотеза про те, що віруси походять з «утікача» нуклеїнової кислоти, тобто нуклеїнової кислоти, що набула спроможність реплікуватись незалежно від тієї клітини, із якої виникла, хоча при цьому передбачається, що така ДНК реплікується з використанням структур цієї або іншої клітин.
На підставі дослідів фільтрації через градуйовані лінійні фільтри були визначені розміри вірусів. Виявилося, що розмір найдрібніших із них становив 20-30 нанометрів, а найбільших — 300—400 нанометрів.
У процесі подальшої еволюції у вірусів змінювалася більше форма, аніж хімічна будова.
Будова віріонів
Приклади структур ікосаедричних віріонів.
А. Вірус, що не має ліпідної оболонки (наприклад, пікорнавірус).
B. Оболонковий вірус (наприклад герпесвірус).
Розміри більшості вірусів коливаються від 10 до 300 нм. У середньому віруси в 50 разів менші за бактерій. Їх неможливо побачити у оптичний мікроскоп, тому що їх розмір менший за довжину світлової хвилі.
Віруси складаються з різноманітних компонентів:
1. серцевина — генетичний матеріал (ДНК або РНК). Генетичний апарат вірусу кодує від декількох (Вірус Тютюнової Мозаїки) до сотень генів (Вірус Віспи, більше 100 генів). Необхідний мінімум — гени, що кодують вірус-специфічну полімеразу та структурні білки.
2. білкова оболонка, що називають капсидом. Оболонка часто побудована з ідентичних повторюваних субодиниць — капсомерів. Капсомери утворюють структури з високою симетрією.
3. додаткова ліпопротеїдна оболонка. Ліпідна оболонка походить з плазматичної мембрани клітини-хазяїна та зустрічається в порівняно складних вірусів (вірус грипу, вірус герпесу). Цілком сформована інфекційна вірусна частка називається віріоном.
Культивування та розмноження вірусів.
Культивування вірусів тварин. У 1932 p. E. Гудпасчером зі співавторами було запропоновано метод культивування вірусів в ембріонах курчат. Цей метод економічний і зручний. Його й нині широко застосовують для культивування багатьох вірусів тварин. Матеріал, що містить вірус, вводять за допомогою шприца або іншим шляхом у курячий ембріон на 8—12-й день його розвитку
Результати дослідів показали, що більшість видів вірусів добре розвивається в амніоні, жовтковому мішку, хоріоналантоїсній оболонці та інших частинах ембріона.
У 50-х роках у практику було впроваджено методи культивування клітинних культур, які істотно вплинули на розвиток вірусології. Тепер віруси успішно культивуються в культурах одношарових трипсинозованих клітин, які виготовляють з ембріональних тканин курей, кроликів, морських свинок, мишей, а також нирок мавп і ембріонів людини. Широко культивуються віруси І в так званих перещеплюва них культурах клітин — штамах тканин (СОЦ-серце мавп ціномольгус, R, К-нирки кролика та ін.), злоякісних пухлин (Hela, Hep-2, KB) тощо. Велика перевага перещеплюваних клітинних ліній, в порівнянні з первинними культурами, полягає в тому, що їх можна розмножувати послідовним пасажуванням протягом тривалого часу.
Наприклад, культура клітин Hela, одержана Дж. Геймом з пухлини хворої жінки Генрієти Лекс ще в 1950 p., до сьогоднішнього часу пройшла тисячі генерацій і використовується нині у всіх вірусологічних лабораторіях світу.
Культури клітин використовуються не тільки для первинного виділення вірусу, але й для виробництва вакцин, коли необхідно одержати чималу масу вірусного матеріалу. Вирощування вірусів у клітинних культурах широко застосовується і для біохімічних досліджень.
Культивування вірусів проводять також в організмі чутливих лабораторних тварин, зокрема тих вірусів, які не вирощуються в клітинних культурах і ембріонах курчат. Так, для вивчення онкогенних вірусів використовують хом’ячків, агента куру і вірусу гепатиту — приматів, вірусів Коксакі та арбовірусів — мишей. За допомогою кроликів одержують антисироватки. Експерименти з вивчення механізмів патогенезу і ролі імунної відповіді можуть бути проведені тільки на лабораторних тваринах.
Культивування вірусів рослин. Для культивування фітопатогенних вірусів використовують сприйнятливі до них рослини, які вирощують у природних умовах або в теплицях і оранжереях.
Механізм взаємодії з клітиною
Умовно процес вірусного інфікування в масштабах однієї клітини можна розбити на декілька етапів, що взаємоперекриваються:
· Приєднання до клітинної мембрани — так звана адсорбція. Зазвичай для того, щоб віріон адсорбувався на поверхні клітини, вона повинна мати у складі своєї плазматичної мембрани білок (часто глікопротеїн) — рецептор, специфічний для даного віруса. Наявність рецептора нерідко визначає коло господарів даного вірусу, а також його тканинну специфічність.
· Проникнення в клітину. На наступному етапі вірусу необхідно доставити всередину клітини свою генетичну інформацію. Деякі віруси вносять також власні білки, необхідні для її реалізації (особливо це характерно для вірусів, що містять негативні РНК). Різні віруси для проникнення в клітину використовують різні стратегії: наприклад, пікорнавіруси уприскують свої РНК через плазматичну мембрану, а віріони ортоміксовірусів захоплюються клітиною в ході піноцитозу, потрапляють в кисле середовище лізосом, де відбувається їх остаточне дозрівання (депротеїнізация вірусної частинки), після чого РНК в комплексі з вірусними білками долає лізосомальну мембрану і потрапляє в цитоплазму. Віруси також розрізняються за локалізацією їх реплікації, частину вірусів (наприклад, ті ж пікорнавіруси) розмножується в цитоплазмі клітини, а частина (наприклад ортоміксовіруси) у її ядрі.
· Перепрограмування клітини. При зараженні вірусом в клітині активуються спеціальні механізми противірусного захисту. Заражені клітини починають синтезувати сигнальні молекули — інтерферони, які переводять навколишні здорові клітини у противірусний стан і активують системи імунітету. Пошкодження, що викликаються розмноженням вірусу в клітині, можуть бути виявлені системами внутрішнього клітинного контролю, і така клітина повинна буде «покінчити життя самогубством» в ході процесу, званого апоптозом або програмованій клітинній смерті. Від здатності вірусу долати системи противірусного захисту безпосередньо залежить його виживання. Тож недивно, що багато вірусів (наприклад пікорнавіруси флавівіруси) в ході еволюції набули здатності пригнічувати синтез інтерферонів, апоптозну програму і так далі. Окрім придушення противірусного захисту, віруси прагнуть створити у клітині максимально сприятливі умови для розвитку свого потомства. Хрестоматійним прикладом перепрограмування систем клітини-хазяїна є трансляція РНК ентеровірусів(родина пікорнавіруси). Вірусна протеаза розщеплює клітинний білок eIF4G, необхідний для ініціації трансляції переважної більшості клітинних мРНК (що транслюються за так званим кеп — залежним механізмом). При цьому ініціація трансляції РНК самого вірусу відбувається іншим способом (IRES — залежний механізм), для якого цілком достатньо відрізаного фрагмента eIF4G. Таким чином, вірусні РНК набувають ексклюзивних «прав» і не конкурують за рибосоми з клітинними.
· Персистенція. Деякі віруси можуть переходити в латентний стан (так звана персистенція для вірусів еукаріотів або лізогенія длябактеріофагів — вірусів бактерій), слабо втручаючись у процеси, що відбуваються в клітині, і активуватися лише за певних умов. Така побудована, наприклад, стратегія розмноження деяких бактеріофагів — до тих пір, поки заражена клітина знаходиться в сприятливому середовищі, фаг не вбиває її, успадковується дочірніми клітинами і нерідко інтегрується в клітинний геном. Проте при попаданні зараженої лізогенним фагом бактерії в несприятливе середовище, збудник захоплює контроль над клітинними процесами так, що клітина починає виробляти матеріали, з яких будуються нові фаги (так звана літична стадія). Клітина перетворюється на фабрику, здатну утворювати тисячі фагів. Зрілі частинки, виходячи з клітини, розривають клітинну мембрану, тим самим убиваючи клітину. З персистенцією вірусів (наприклад паповавірусів) пов’язані деякі онкологічні захворювання.
· Створення нових вірусних компонентів. Розмноження вірусів у найзагальнішому випадку передбачає три процеси — 1) транскрипціявірусного генома — тобто синтез вірусної мРНК, 2) її трансляція, тобто синтез вірусних білків і 3) реплікація вірусного генома (у деяких випадках геном РНК одночасно грає роль мРНК, тоді перший процес є практично тим же, що і третій). У багатьох вірусів існують системи контролю, що забезпечують оптимальне витрачання біоматеріалів клітини-господаря. Наприклад, коли вірусної мРНК накопичено достатньо, транскрипція вірусного генома пригнічується, а реплікація навпаки — активується.
· Дозрівання віріонів і вихід з клітини. Врешті-решт, новосинтезовані геноми РНК або ДНК «одягають» відповідні білки і виходять з клітини. Слід сказати, що вірус, який активно розмножується, не завжди вбиває клітину-господаря. В деяких випадках (наприкладортоміксовіруси) дочірні віруси відгалужуються від плазматичної мембрани, не викликаючи її розриву. Таким чином, клітина може жити далі й продукувати вірус.
Те, чи можна віруси вважати живими, залежить від прийнятого визначення життя. Зазвичай віруси вважаються живими за «функціональним» визначенням життя, проте не — за «структурним».
Функціональне означення життя полягає на сформуванні списку аксіом, які не відштовхуються від його структури, які мусить виконувати кожен організм, щоб його можна було визнати живим. Він повинен (одна з можливих аксіоматизацій, хоча усі вони означають приблизно те саме):
· здатність до розмноження;
· виказувати спадкову мінливість, яка впливає на можливості розмноження, тобто бути здатним до еволюції.
Отже кристали, пріони чи комп’ютерні віруси, хоча й здатні розмножуватися, не володіють жодними істотними спадковими рисами, отже не є живими. Біологічні віруси згідно з цим визначенням, є живими.
Структурне визначення життя полягає у встановленні списку критеріїв, які відштовхуються від структури організму. Це, між іншим:
· ріст
· клітинна будова, з рибосомами та іншими органелами
· генетичний матеріал, який зберігається у вигляді нуклеїнових кислот
· наявність білка і нуклеїнових кислот
· рух
На відміну від функціонального визначення, тут не має визначеного набору умов, у більшості таких наборів віруси не задовольняють принаймні одну з таких умов.
Класифікація
В таксономії живої природи віруси виділяються до окремого таксону Vira, що утворює в класифікації Systema Naturae 2000 разом з доменами Bacteria, Archaea і Eukaryota кореневий таксон Biota. Протягом XX століття в систематиці висувалися пропозиції про створення виділеного таксона для неклітинних форм життя (Aphanobionta Novak, 1930; надцарство Acytota Jeffrey, 1971; Acellularia), проте такі пропозиції не кодифіковано.
1. Віруси класифікуються на ті, що містять ДНК (вірус простого герпесу) і ті, що містять РНК (вірус імунодефіциту людини).
2. За структурою капсомерів. Ізометричні (кубічні), спіральні, змішані.
3. За наявністю або відсутністю додаткової ліпопротеїнової оболонки (суперкапсиду) віруси поділяються на прості та складні.
4. За клітинами-хазяїнами
Найбільш вживана в теперішній час класифікація вірусів запропонована лауреатом Нобелівської премії Девідом Балтимором. Вона побудована на типі нуклеїнової кислоти, що використовується вірусом для переносу спадкового матеріалу, та на тому, яким шляхом відбувається її експресія та реплікація. Варто зазначити, що така класифікація не віддзеркалює філогенетичні зв’язки між видами вірусів, тому що віруси, згідно з загальноприйнятим зараз поглядом, мають механізми походження, відмінні від усіх інших організмів.
На відміну від клітинних організмів, генетична інформація яких зберігається у вигляді дволанцюгової ДНК, геном віруса може зберігатись як у вигляді дво-, так одноланцюгової нуклеїнової кислоти. При цьому цією кислотою може бути як ДНК, так і РНК, матрична форма якої (м-РНК) використовується в клітинах як проміжний продукт при трансляції генетичної інформації в процесі синтезупротеїнів. РНК-геноми вірусів можуть бути закодовані в двох протилежних напрямках: або гени розташовані в напрямку від 5′-кінця молекули до 3′-кінця (позитивний напрямок, або +полярність), аналогічно напрямку розташування генів в м-РНК в клітинах, або гени вірусного геному розташовані в протилежному напрямку (негативний напрямок, або -полярність).
Таксономія вірусів в основних рисах схожа на таксономію клітинних організмів. Таксономічні категорії, що використовуються в класифікації вірусів, такі (в дужках наведені суфікси для утвореннялатинських назв):
· Ряд (-virales)
· Родина (-viridae)
· Підродина (-virinae)
· Рід (-virus)
· Вид
Але в номенклатурі вірусів є і деякі особливості, що відрізняють її від номенклатури клітинних організмів. По-перше, назви не тільки видів і родів, але також рядів і родин пишуться курсивом; по-друге, на відміну від класичної ліннеєвської номенклатури, назви вірусів не є біномінальними (тобто утвореними з назви роду та епітету виду — докладніше див. в статті «Біологічна класифікація»). Зазвичай назви вірусів утворюються в формі [Хвороба]-вірус.
Загалом на теперішній час описано близько 80 родин, в які входять приблизно 4000 окремих видів вірусів.
Розподіл родин на ряди розпочався нещодавно і відбувається повільно; на теперішній час (2005 рік) виділено та описано діагностичні ознаки тільки трьох рядів, і більшість описаних родин є некласифікованими.
Класифікація за типом геному
В даній класифікації назви типових представників таксонів перекладені українською мовою у разі наявності загальноприйнятого наукового терміну; в інших випадках наведено міжнародно прийняту латинську назву згідно з постановою Міжнародного Комітету з таксономії вірусів (International Committee on Taxonomy of viruses).
ДНК–віруси
Група І — дволанцюгові ДНК–віруси (dsDNA viruses)
· Ряд Caudovirales (tailed bacteriophages).
· Родина Myoviridae — типовий представник: Ентеробактеріальний фаг T4
· Родина Podoviridae
· Родина Siphoviridae — типовий представник: Ентеробактеріальний фаг О
· Некласифіковані
· Родина Ascoviridae
· Родина Adenoviridae
· Родина Asfiviridae
· Родина Baculoviridae
· Родина Corticoviridae
· Родина Fuselloviridae
· Родина Guttaviridae
· Родина Herpesviridae — типовий представник: Вірус герпесу людини
· Родина Iridoviridae
· Родина Lipothrixviridae
· Родина Nimaviridae
· Родина Papillomaviridae
· Родина Phycodnaviridae
· Родина Plasmaviridae
· Родина Polyomaviridae — типовий представник: Вірус мавп 40
· Родина Poxviridae — типові представники: Вірус коровячої віспи, Вірус віспи людини
· Родина Rudiviridae
· Родина Tectiviridae
· Некласифіковані роди
· Мімівірус; типовий представник: Acanthamoeba polyphaga mimivirus (вірус амеби Acanthamoeba polyphaga) — другий найбільший з відомих вірусів.
· Родина Megaviridae
· Megavirus – найбільший відомий вірус
Група II — одноланцюгові ДНК-віруси (ssDNA viruses)
· Некласифіковані бактеріофаги
· Родина Inoviridae
· Родина Microviridae
· Некласифіковані віруси
· Родина Geminiviridae
· Родина Circoviridae
· Родина Nanoviridae
· Родина Parvoviridae — типовий представник: Парвовірус Б19 (для розвитку потребує спільного інфектування з аденовірусами)
· Некласифіковані роди
· Рід Anellovirus; типовий представник: Спіральний вірус тено
РНК-віруси
Група III — дволанцюгові РНК-віруси (dsRNA viruses)
·
· Родина Birnaviridae
· Родина Chrysoviridae
· Родина Cystoviridae
· Родина Hypoviridae
· Родина Partitiviridae
· Родина Reoviridae — типовий представник: Ротавірус діареї людини
· Родина Totiviridae
· Некласифіковані роди
· Рід Endornavirus; типовий представник: Вірус бобової гнилі
Група IV — позитивно спрямовані одноланцюгові РНК-віруси ((+)ssRNA viruses)
· Ряд Nidovirales («Гніздові» віруси)
· Родина Arteriviridae
· Родина Coronaviridae — типові представники: Коронавірус пневмонії, вірус SARS.
· Родина Roniviridae
· Некласифіковані
· Родина Astroviridae
· Родина Barnaviridae
· Родина Bromoviridae
· Родина Caliciviridae — типові представники: Norwalk-віруси тютюну та картоплі
· Родина Closteroviridae
· Родина Comoviridae
· Родина Dicistroviridae
· Родина Flaviviridae — типові представники: Вірус Жовтої лихоманки, Вірус Нільської лихоманки, Вірус Гепатиту С
· Родина Flexiviridae
· Родина Hepeviridae — типовий представник: Вірус Гепатиту Е
· Родина Leviviridae
· Родина Luteoviridae
· Родина Marnaviridae
· Родина Narnaviridae — безоболонкові РНК-віруси
· Родина Nodaviridae
· Родина Picornaviridae — типові представники: вірус Поліомієліту, Вірус Гепатиту А
· Родина Potyviridae
· Родина Sequiviridae
· Родина Tetraviridae
· Родина Togaviridae — типовий представник: Вірус Краснухи
· Родина Tombusviridae
· Родина Tymoviridae
· Некласифіковані роди
Група V — негативно спрямовані одноланцюгові РНК–віруси ((-)ssRNA viruses)
· Ряд Mononegavirales (несегмнтовані негативно спрямовані РНК–віруси)
· Родина Bornaviridae — типовий представник: Borna disease virus
· Родина Filoviridae — типовий представник: Вірус Еболи
· Родина Paramyxoviridae — типовий представник: Вірус Кору
· Родина Rhabdoviridae — типовий представник: Вірус Сказу
Сегментовані негативно спрямовані РНК-віруси
· Родина Arenaviridae
· Родина Bunyaviridae — типовий представник: Hantavirus
· Родина Orthomyxoviridae — типовий представник: Віруси Грипу
· Некласифіковані роди:
· Рід Deltavirus; типовий представник: Вірус Гепатиту D (Гепатиту Дельта)
· Рід Ophiovirus; типовий представник: Citrus psorosis virus
· Рід Tenuivirus; типовий представник: Вірус строкатості рису
· Рід Varicosavirus; типовий представник: Вірус роздутості жилок салату
ДНК- та РНК-віруси, що здійснюють зворотну транскрипцію
Група VI — одноланцюгові зворотно-транскрипційні РНК-віруси (ssRNA–RT viruses)
·
· Родина Metaviridae
· Родина Pseudoviridae
· Родина Retroviridae — Ретровіруси, типовий представник: Вірус імунодефіциту людини
Група VII — дволанцюгові зворотно-транскипційні ДНК-віруси (dsDNA–RT viruses)
·
· Родина Hepadnaviridae — типовий представник: Вірус Гепатиту В
· Родина Caulimoviridae — типовий представник: Вірус мозаїки кольорової капусти
Індукція синтезу інтерферонів
При внутрішньоклітинній репродукції вірусу індукується синтез альфа- та бета-інтерферонів, які захищають інші клітини від вірусу. А при фагоцитозі віріонів макрофагами індукується синтез гамма-ітерферонів Th1 лімфоцитами.
Інтерферони спричинюють в клітині синтез ферментів що порушують трансляцію мРНК, внаслідок чого репродукція вірусу стає неможливою. Проте, це також припиняє синтез клітинних білків що унеможливлює поділ клітин. Інтерферони не є вірусспецифічними, тобто інферферони виділені у відповідь на вторгнення одного вірусу також пригнічують репродукцію інших, але є видоспецифічними, тобто пригнічують репродукцію вірусу тільки в клітинах свого виду.
Елімінація заражених вірусом клітин
Під час репродукції вірусу його антигени подаються на мембрану клітини, разом з антигенами головного комплексу гістосумісності. Там вони розпізнаються цитотоксичними T-лімфоцитами CD8. Ці лімфоцити знищують інфіковані вірусом клітини, зупиняючи поширення вірусу і забезпечуюючи тривалий імунітет.
Також заражені клітини розпізнаються і знищуються природними кілерами. Противірусні антитіла реагують з відповідними антигенами на поверхні клітини і блокують їх. Природні кілери здатні розпізнавати такі антитіла і знищувати клітини на яких вони адсорбовані.
Заражені клітини може знищувати також система комплементу. При цьому, вона може активуватись як за класичними (вірусні антигени на поверхні – противірусні антитіла) так і альтернативними механізмами.
Елімінація та нейтралізація віріонів
Позаклітинні віруси усуваються з організму за допомогою фагоцитозу, хоча деякі з них можуть зберігатись і розмножуватись у фагоцитах. Макрофаги здійснюють презентацію вірусних антигенів; при розпізнаванні таких антигенів B-лімфоцитами та Th2-клітинами розвивається гуморальна імунна відповідь і синтез антитіл. IgG нейтралізують віруси переважно у тканинній рідині, IgM – у крові, а секреторні IgA – на поверхні слизових. Віруси що перебувають у клітині не піддаються дії антитіл. Комплекси антитіл з вірусами активно фагоцитуються макрофагами. Також віріони руйнуються внаслідок активації комплементу.
