Визначення якості ЛЗ хроматографічними методами

 

Визначення якості хроматографічними методами

 

ХРОМАТОГРАФІЯ

Хроматографія — це метод розділення, аналізу і фізико-хімічного дослідження речовин, який ґрунтується на відмінності в швид­кості руху концентраційних зон компонентів, що досліджуються, котрі переміщуються в потоці рухомої фази (елюента) вздовж шару не­рухомої фази, причому сполуки, що досліджуються, розподілені між обома фазами. Зазвичай нерухома фаза — це сорбент з розви­неною поверхнею або рідина, адсорбована на твердому носії; ру­хома — потік газу (пари) або рідини, який фільтрується через шар  сорбенту. Обов’язковою умовою хроматографічного розділення речовин є відмінність у рівноважному або кінетичному розподі­ленні компонентів суміші між фазами. Відношення швидкості пе­реміщення речовини до швидкості переміщення елюента позна­чають R_f (від англ, «relative front» — відносно фронту).

 

ВИДИ ХРОМАТОГРАФІЇ (КЛАСИФІКАЦІЯ)

         У залежності від агрегатного стану рухомої фази розрізняють: рідинну хроматографію і газову хроматографію, яку, в свою чергу, поділяють на газоадсорбційну і газорідинну.

За геометрією сорбційного шару нерухомої фази розрізняють площинну і колонкову хроматографії. До площинної належать тонкошарова хроматографія (ТШХ) і хроматографія на папері. В колонковій зазвичай виділяють капілярну хроматографію.

За механізмом розділення розрізняють іонообмінну, ексклюзійну, осаджувальну, афінну, адсорбційну і розподільчу хроматографії. Останні два види хроматографії ґрунтуються відповідно на різній сорбованості речовин, що розділяються адсорбентом, і на різній розчинності їх у нерухомій фазі й елюенті.

Рідинна хроматографія, яка ґрунтується на відмінності у здат­ності молекул різних розмірів проникати в пори неіоногенного гелю, котрий служить нерухомою фазою, називається ексклюзійною, або молекулярно-ситовою, хроматографією. Зазвичай розріз­няють гель-проникаючу хроматографію (елюент — органічний розчинник) і гель-фільтрацію (елюент — вода). Ексклюзійну хро­матографію здійснюють, як правило, в рідинних хроматографах. Молекули, які мають у розчині великий розмір, або зовсім не про­никають, або проникають лише в частину пор гелю і вимиваються з колонки раніше, ніж дрібні молекули. У результаті забезпечуєть­ся розподіл молекул за розмірами. Ексклюзійна хроматографія широко застосовується для дослідження, очистки, виділення полі­мерів (у тому числі біополімерів) і визначення їх молекулярно-масового розподілу.

Метод розділення й очистки біологічно активних речовин, що ґрунтується на їх специфічній взаємодії з лігандами, ковалентне пов’язаними з нерозчинними носіями, називається афінною хрома­тографією (біоафінною, біоспецифічною, хроматографією за спорід­неністю). Як ліганди використовують сполуки, взаємодія яких зі сполуками, що розділяються, ґрунтується на біологічній фіксації останніх. Наприклад, при розділенні ферментів як ліганди викорис­товують інгібітори, кофактори, субстрати, при виділенні антитіл або антигенів — відповідні іммобілізовані антигени або антитіла (імуносорбція). Як носії використовують силікати, поліакриламідні гелі, декстрани, целюлозу, агарозу та ін. Суміш, що розділяється, вміщують у склянку з сорбентом і витримують певний час або про­пускають з певною швидкістю через колонку, наповнену сорбен­том, до повного зв’язування компонента, що досліджується. Потім сорбент багатократно промивають буферним розчином для видален­ня речовин, що не зв’язалися, після чого елююють компонент, що досліджується, новою порцією буферного розчину, який містить ліганд, що витісняє зв’язаний компонент. Ефективність розділен­ня залежить від спорідненості між біологічно активною речовиною і лігандом, стеричної доступності і концентрації ліганду на носії. У так званій ковалентній хроматографії використовують носії з SH-групами. Речовини, що розділяються, які також містять SH-групи, утримуються носіями завдяки утворенню дисульфідних зв’язків; компонент, що виділяється, елююють розчином меркаптоетанолу, цистеїну або іншими сполуками. Афінну хроматографію викорис­товують, головним чином, у наукових дослідженнях для виділення ферментів антитіл, гормонів, вірусів, клітин, а також для вивчен­ня четвертинної структури ферментів, їх активного центру, меха­нізму дії і структури нуклеїнових кислот, впливу гормонів на клі­тинні рецептори.

На різній розчинності осадів, які утворюються при взаємодії компонентів суміші, що аналізується, з реагентом-осаджувачем, ґрунтується осаджувальна хроматографія. Осаджувачі, як правило, вводять до складу високодисперсного сорбенту-носія (А12О3, силі­кагель, крохмаль, вугілля, іоніти, фільтрувальний папір). Хроматограмою в осаджувальній хроматографії називають картину роз­поділення хроматографічних зон по шару сорбенту після завер­шення розділення. У колонковій осаджувальній хроматографії розчин, що аналізується, вводять у колонку, наповнену сумішшю носія й осаджувача, у паперовій — на імпрегнований осаджувачем фільтрувальний папір, у тонкошаровій — на пластинку з носієм, що містить певну кількість осаджувача. Отриману при цьому пер­винну хроматограму промивають розчинником або проявником до утворення меж хроматографічних зон компонентів суміші. Хроматограми утворюються в результаті багатократного утворення і розчинення осадів; менш розчинні сполуки закріплюються на по­чатку шару сорбенту, більш розчинні — в кінці.

Осаджувальну хроматографію використовують для аналізу не­органічних речовин, у тому числі сполук перехідних, рідкіснозе­мельних і розсіяних елементів, а також роданід- і галогенід-іонів. Кількісний аналіз ґрунтується на залежності розміру хроматогра­фічної зони від концентрації (кількості) речовини. Як правило, концентрацію компонента визначають за градуювальним графі­ком, побудованим у координатах розмір зони — кількість компо­нента в розчині.

Найчастіше у фармацевтичному аналізі застосовують іонооб­мінну, адсорбційну і розподільчу хроматографії.

 ІОНООБМІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

В основі іонообмінної хроматографії лежить оборотна хемосорб­ція іонів розчину, що аналізується, іоногенними групами сорбен­ту. Оборотний обмін іонами в системі сорбент — розчинник проті­кає в цьому випадку з додержанням стехіометричних співвідно­шень. Стаціонарною фазою слугують катіоно- або аніонообмінні смоли. Макромолекули катіонітів містять кислотні групи різної сили, такі як сульфо-, карбоксильні і оксифенільні групи. Макро­молекули аніонітів, навпаки, мають у своєму складі основні гру-, наприклад, аліфатичні або ароматичні аміногрупи різного ступе­ня заміщеності. Процес обміну можна подати такими рівняннями: а) катіонний обмін:

 

Катіон обмінюється на іон водню, яким заряджений катіоніт, і сіль перетворюється у відповідну кислоту; б) аніонний обмін:

 

Аніон обмінюється на гідроксид-іон, і сіль перетворюється у відповідну основу. Особливістю смол є можливість багатократної регенерації, після якої відновлюється їх іонообмінна здатність.

Іонообмінну хроматографію можна застосовувати для розді­лення суміші катіонів або аніонів. Для розділення суміші катіонів використовують катіоніти, для розділення аніонів — аніоніти. Елю­ентом слугує в першому випадку розчин кислоти, а в другому — розчин лугу. Залежно від спорідненості нерухомої фази до фіксо­ваних іонів, іони, що розділяються, переміщуються вздовж хрома­тографічної колонки з різними швидкостями; чим більша спорід­неність, тим більший об’єм утримування компонента.

Іонообмінну хроматографію застосовують для розділення фе­нолів і карбонових кислот (на аніонітах), аміноцукрів, нуклеотидів, нуклеозидів, пуринових, піримідинових та інших основ (на сульфокатіонітах). Іоніти використовують також для відділення електролітів від неелектролітів (у тому числі від цукрів, ароматич­них вуглеводнів).

У фармацевтичному аналізі іонообмінну хроматографію засто­совують для кількісного визначення лікарських речовин — солей сульфатної, цитринової та інших кислот. При цьому її поєднують з кислотно-основним титруванням. Іноді іонообмінну хромато­графію поєднують з комплексонометрією. Для цього застосовують катіоніти не в Н⁺-, а в Zn^2+-формі. Такий метод використовують, наприклад, для кількісного визначення сумішей амінопохідних або алкалоїдів у екстрактах чи настоянках.

 

АДСОРБЦІЙНА ХРОМАТОГРАФІЯ

В основі адсорбційної хроматографії лежить безперервний об­мін однією або декількома речовинами, що хроматографуються, між нерухомою (твердою або рідкою) і рухомою фазами. Цей про­цес зумовлений існуванням на поверхні розділу фаз динамічної рівноваги між процесами адсорбції і десорбції розчинених у рухо­мій фазі речовин, що хроматографуються.

Одні речовини мають менший коефіцієнт адсорбції, краще розчиняються в рухомій фазі, інші — більшу спорідненість до сор­бенту, краще адсорбуються. За рахунок цього при проходженні рухомої фази через сорбент одні речовини просуваються вперед швидше, інші дещо відстають, і таким чином відбувається розді­лення суміші речовин.

Для ефективного розділення вирішальне значення мають:

– властивості адсорбенту (розміри його часток, розвиненість поверхні, розміри пор);

– властивості розчинника, який використовується для одер­жання хроматограм;

– концентрація розчину речовин.

Найчастіше для адсорбційної хроматографії як нерухому фазу використовують тверді сорбенти: діатоміт, кремнієву кислоту, кізельгур, силікагель, алюмінію окис, активоване вугілля, молеку­лярні сита й різноманітні полімери.

При підборі рухомої фази керуються елюотропним рядом роз­чинників за Шталем: гексан, гептан, циклогексан, тетрахлорметан, бензол, хлороформ, ефір, етилацетат, піридин, ацетон, етанол, метанол, вода. Розчинники в елюотропному ряду розташовані в порядку збільшення полярності (діелектричної проникності).

РОЗПОДІЛЬЧА ХРОМАТОГРАФІЯ

В основі розподільчої хроматографії лежить процес безперерв­ного перерозподілу речовин, що хроматографуються, між двома фазами (рухомою і нерухомою), причому ці речовини розчинені в кожній із фаз. Інертний носій просочують спеціальним розчинни­ком (нерухома фаза), вводять розчин суміші, що аналізується, і пропускають інший розчинник, який не змішується з першим (ру­хома фаза; в газовій хроматографії рухомою фазою є газ).

Завдяки різній розчинності компонентів суміші в обох фазах згідно з коефіцієнтами їх розподілення встановлюється рівновага між кількістю речовини, розчиненої в нерухомій і рухомій фазах. При безперервному протіканні рухомої фази спостерігається роз­ділення суміші, що аналізується, на компоненти. Якщо процес виконувати на колонці, відбувається розділення суміші на зони, які містять по одному компоненту. Розподільчу хроматографію можна виконувати також у тонкому шарі сорбенту (тонкошарова хроматографія) і на хроматографічному папері (паперова хромато­графія).

 

ХРОМАТОГРАФІЯ В ТОНКОМУ ШАРІ СОРБЕНТУ (ТШХ)

Хроматографічний процес, який протікає при проходженні рухомої фази в тонкому шарі сорбенту (носія), нанесеному на інер­тну поверхню, називається хроматографією в тонкому шарі сор­бенту. Механізм хроматографічного розділення може бути різним, але найчастіше він адсорбційний. Переміщення рухомої фази в шарі сорбенту з метою спрощення апаратного оформлення проце­су хроматографування, як правило, здійснюють висхідним мето­дом, тобто під дією капілярних сил.

Обладнання. Зазвичай використовують скляні, алюмінієві або пластикові пластини розміром 10×10, 15×15, 20×20 см², вкриті ша­ром сорбенту (товщина шару звичайно 0,25 мм). У фармакопеях подаються методики нанесення тонкого шару, однак останнім ча­сом у фармацевтичному аналізі практично повністю перейшли на промислові пластини з закріпленим шаром сорбенту.

Процес хроматографування проводять у прямокутних або ци­ліндричних скляних посудинах, закритих герметично пришліфо­ваною кришкою (хроматографічних камерах). На дно камери на­ливають систему розчинників, у яку занурюють хроматографічну пластинку з нанесеними зразками.

Для горизонтального елюювання хроматографічна камера має жолоб для рухомої фази і додатково містить пристрій для подачі рухомої фази до нерухомої.

Застосовують мікропіпетки, мікрошприци, калібровані капіля­ри або інші пристрої, придатні для нанесення розчинів.

Нерухома фаза. Як сорбенти використовують різноманітні мо­дифікації алюмінію окису, целюлози, кізельгуру, силікагелю з до­бавками зв’язувальних агентів, таких як кальцію сульфат або крох­маль. Застосовують також силанізовані сорбенти. Силанізування дозволяє пригнітити активні центри сорбенту. При цьому його тип (прямофазний) не змінюється. Силанізовані сорбенти слід від­різняти від сорбентів з прищепленими алкільними групами (як правило, вуглеводневі радикали), які звичайно є оберненофазними. Термін «оберненофазний» означає, що звичайний («прямий») порядок зміни елююючої сили в елюотропному ряду розчинників змінюється на цих сорбентах на зворотний.

У вітчизняній практиці звичайно використовують такі марки готових пластин:

— прямофазні — «Silufol» (Чехія), «Сорбфил» (Росія), «Merck» (Німеччина) — звичайні або з підкладкою, що флуоресціює при 254 і/або 365 нм;

—   оберненофазні — «Сорбтон» (Росія), «Merck» (Німеччина) — звичайні і з підкладкою, що флуоресціює при 254 і 365 нм.

Перед використанням готові пластини зі скляною та алюміні­євою підкладками звичайно активують нагріванням упродовж 1 год при 100—105 °С, іноді до 120 °С, для видалення вологи, що знижує активність сорбенту. Пластини з полімерною підкладкою терміч­ній активації не підлягають.

Іноді перед використанням пластини промивають, елююючи чистий розчинник або систему розчинників.

Одним із варіантів ТШХ є хроматографія на поліамідних плів­ках. Високу ефективність хроматографічного розділення дають такі сорбенти, як поліамідна крихта марки Б і поліетилентерефталева плівка.

Рухома фаза. Вибір рухомої фази в ТШХ має забезпечити ви­конання трьох головних умов:

–         добре розділення сполук, що досліджуються;

–         висока чутливість виявлення цих сполук;

–         добра відтворність величин Rf.

Виконання умов 1 і 2 немалою мірою пов’язано з оптималь­ним значенням R_f сполук, що досліджуються. Розглянемо експе­риментальну залежність значень R_f від складу бінарної рухомої фази. Бінарні рухомі фази складаються з розріджувача й активного (в елююючому сенсі) компонента. Якщо концентрація активного компонента бінарної рухомої фази буде великою, значною буде і її елюююча сила, а відповідно і значення R_f речовин, що аналізують­ся. Площа хроматографічної зони (плями) зростає (а чутливість детектування падає) приблизно пропорційно квадрату величини R_f, тому оптимальними значеннями R_f встановленні тотожно­сті можна вважати значення R_f= 0,4—0,6. При контролі домішок для підвищення чутливості величини їх R_f доцільно зменшити до 0,2-0,4.

При маленьких величинах R_f (менш ніж 0,2) збільшується ві­рогідність перевантаження плям, що призводить до зміни форм плям і погіршення їх розділення, крім того деякі речовини можуть просто не встигнути розділитися.

Важливим питанням є відтворність величин R_f яка значною мірою пов’язана з поняттям функціональної стійкості рухомої фази, що вважається фукціонально стійкою, якщо невеликі зміни її складу не викликають значних змін величин R_f. Найбільша нестійкість величин R_f спостерігається при невеликому вмісті активного ком­понента рухомої фази.

Оптимізація розділення шляхом зміни складу рухомої фази — одна з найважчих і ще не вирішених проблем рідинної хроматографії. Дослідження доцільно починати з чистих розчинників. Не­обхідно знайти такий розчинник, у якому сполуки, що досліджу­ються, мали б значення R_f близько 0,4—0,7. При цьому доцільно керуватися елюотропним рядом розчинників.

Якщо сполуки, що досліджуються, є кислотами, то для пригні­чення їх дисоціації до складу рухомої фази доцільно додати 1—2 % льодяної оцтової кислоти. У тому випадку, коли сполуки, що до­сліджуються, є солями органічних основ (які малорухомі на силі­кагелі), для перетворення їх на більш рухомі вільні основи доціль­но додати до рухомої фази 2—5 % ампульного 10 %-вого розчину амоніаку.

Після того як обрано чистий розчинник, у якому значення R_f становлять 0,4—0,7 (з добавками або без), його розбавляють ін­шим розчинником, у якому величини R_f незначні (бажано близькі до 0), до одержання необхідного R_f розділення.

Для розділення не дуже полярних сполук рекомендують такі бінарні системи: гексан-ацетон (або етилацетат); бензол-ацетон (або етилацетат); бензол-метанол.

Перевірка придатності хроматографічної системи. Відмінність в активності різних марок сорбенту того самого типу (наприклад силікагелю) нерідко буває дуже значною, що викликає великі ко­ливання величин R_f сполук, що досліджуються, й ускладнює вве­дення методик ТШХ до науково-технічної документації.

З метою перевірки якості хроматограм розроблено тести «Під­твердження сили розділення» і «Підтвердження чутливості» хро­матографічних систем.

Тест «Підтвердження сили розділення» проводять шляхом на­несення на пластинку і наступного хроматографування в рухомій фазі спеціального стандартного розчину, який містить два або біль­ше компонентів проби, що досліджується, або пробу, що дослі­джується, з додаванням однієї або двох сполук. Після хроматогра­фування компоненти цього розчину повинні чітко ділитися. У де­яких випадках указують приблизні значення R_f для стандартних речовин. У кожному випадку природа стандартних речовин, склад стандартного розчину, кількості, що наносяться, приблизні зна­чення R_f, які дозволяють оцінити здатність до розділення, регла­ментуються у відповідних монографіях. Цей тест може проводити­ся одночасно з основним тестом.

Тест «Підтвердження чутливості» дозволяє оцінити чутливість проявлення. Він полягає в тому, що наноситься певна кількість стандартної речовини, близька до межі чутливості, проводиться хроматографування в умовах основного тесту і проявлення тим же проявником. На хроматограмі має бути чітко видно відповідну пляму.

              Зазвичай обидва тести поєднують. При цьому деякі компонен­ти стандартного розчину мають чітко ділитися, а одне нанесення (з малою концентрацією на межі чутливості) повинно бути чітко видним. Як правило, обидва тести проводять разом із основним тестом.

Нанесення на пластинку. На певній відстані від краю хромато­графічної пластинки, вибраній таким чином, щоб при зануренні рухома фаза не торкалася нанесеної речовини, графітовим олів­цем проводять «лінію старту», на якій відмічають місця нанесення проб (рис. 4.20).

Якщо немає інших указівок у відповідних монографіях, проби наносять на відстані не менше 15 мм від нижнього краю пластини і не менше 10 мм від бокових країв. Відстань між пробами на лінії старту має бути 20—30 мм, але не менш ніж 10 мм. Пробу, що до­сліджується, рекомендують наносити на пластинку у вигляді роз­чинів у хлороформі або ацетоні. Рідини, що мають більш низьку

температуру кипіння (наприклад, діетиловий ефір), збільшують помилку при нанесенні і діаметр плями, який не повинен переви­щувати 2 мм. Збільшення плями, що наноситься, сильно познача­ється на розмірах плям, отриманих у результаті хроматографування, погіршуючи розділення, особливо при малих R_f. Тому загальний об’єм проби, що наноситься, не повинен сильно перевищувати 0,01 мл. Відповідно підбирається концентрація розчину. Кількість речовини, що наноситься на хроматограму, залежить від завдання.

У разі проведення тесту «Тотожність» нанесення має бути та­ким, щоб не було перевантаження, яке призводить до зміни (як правило, росту) значень R_f. Звичайно це 10—20 мкг у плямі. У разі контролю домішок нанесення (навантаження) основної речовини може бути істотно більшим. Звичайно воно становить 100 мкг.

Проявлення (детектування). Виявлення плям (зон) речовин на хроматограмі здійснюють різними способами: візуально, якщо ре­човини утворюють забарвлені плями; за допомогою УФ-світла, якщо речовини флуоресціюють чи фосфоресціюють або на плас­тинку нанесено відповідний флуоресцентний індикатор; за допо­могою спеціальних детектуючих реактивів (проявників) по утво­ренню забарвлених плям після оббризкування, обробки парами або занурювання пластинки в реагент.

У разі контролю специфічних домішок краще використовува­ти специфічні проявники. При перевірці хроматографічної чисто­ти доцільно застосовувати неспецифічні проявники: УФ-світло (254 нм), пари йоду, 1 %-вий спиртовий розчин феруму (III) хло­риду з подальшим підігрівом та ін.

Основне застосування ТШХ — ідентифікація і контроль домі­шок. Нерідко ці розділи об’єднують.

Визначення якості ЛЗ хроматографічними методами

 

Базовий набір для ТСХ (розширений)

• УФ-кабінет 254/365 (ультрафіолетова лампа) – 1 шт.

• Спрей-камера  (камера для забарвлення хроматограм методом оприскування) – 1 шт.

• Столик с підігрівом для нанесения зразків на пластини – 1 шт.

• Камера хроматографічна (для пластин 15×15 см) – 2 шт.

• Камера хроматографічна (для пластин 10×10 см) – 2 шт.

• Сушильна шафа ШСУ – 1 шт.

• Пульверизатор для агресивних рідин – 1 шт.

• Пульверизатор для маловязких рідин з резиновою “грушею“- 1 шт.

• Мікрошприц V=1 мкл – 1 шт.

• Мікрошприц V=10 мкл – 1 шт.

• Скляні капіляри V=1 мкл -100 шт.

• Мікрокап (тримач капілярів) – 1 шт.

• Пластини на скляній підставці АТСХ (10×10 см) – 20 шт.

• Пластини “Сорбфіл” ПТСХ-П-А 10×10 см – 50 шт.

• Пластини “Сорбфіл” ПТСХ-П-А-УФ 10×10 см – 50 шт.

• Пластини “Сорбфіл” ПТСХ-АФ-А 10×10 см – 50 шт.

• Пластини “Сорбфіл” ПТСХ-АФ-А-УФ 10×10 см – 50 шт.

• Пластини “Сорбфіл” ПТСХ-АФ-В-УФ 10×10 см – 50 шт.

Скляні капіляри

Шприцевой дозатор “MULTISTEP-50” в комплекте с мікрошприцем V=1 мкл

(Аналог РВ-600 фирмы Hamilton)

Столик для нанесення взірців на пластини

Пульверизатори для агресивних та малов`язких рідин

                                                                      Хроматографічна камера

 

ЗАСТОСУВАННЯ ТШХ ДЛЯ ІДЕНТИФІКАЦІЇ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

Існує два підходи при проведенні тесту «Ідентифікація» («То­тожність») за допомогою ТШХ: із застосуванням стандартів речо­вин, що досліджуються, і без стандартів.

У першому випадку на одній і тій самій пластинці паралельно хроматографують пробу, що досліджується, і стандартні зразки речовин-свідків (СЗРС) з концентраціями, які відповідають номі­нальним концентраціям речовин, що досліджуються, в пробі. На хроматограмі повинні спостерігатися плями на рівні плям СЗРС, які мають такий самий вигляд. Для ідентифікації іноді доцільно хроматографувати суміш рівних кількостей речовини, що аналізу­ється, і СЗРС. На хроматограмі має спостерігатися одна пляма.

Перевага такого підходу — найвища можлива (в цих умовах) об’єктивність. Недолік — необхідність наявності СЗРС. Проблема виникає, як правило, під час аналізу препаратів рослинного або тваринного походження, для яких СЗРС не існує. У такому разі іноді застосовують певні «стандартні» субстанції даного рослин­ного або тваринного препарату.

Інший підхід використовують тоді, коли стандарти речовин, що досліджуються, з якихось причин мало доступні. В такому разі в тексті розділу «Тотожність» указується, що на хроматограмі має бути пляма з R_f близько якоїсь величини.

Як уже відзначалося, R_f — це відношення швидкості перемі­щення речовини до швидкості переміщення елюента. Практично в тонкошаровій і паперовій хроматографіях R_f розраховують, як відношення відстані від лінії старту до центру плями до відстані, пройденої від лінії старту фронтом системи розчинників:

де а   — відстань від лінії старту до центру плями;

b — відстань, пройдена від лінії старту фронтом системи роз­чинників.

На величини R_f, що визначаються експериментальне, помітно впливають умови хроматографування (особливо, якщо не вказано марку і виробника сорбенту). Більш точною оцінкою хроматогра­фічної рухомості, мало чутливою до впливу випадкових відхилень в умовах проведення експерименту, є величина R_s — відношення величини R_f  однієї речовини до величини R_f іншої речовини, при­йнятої за стандарт. Зазвичай вибір стандарту здійснюють так, щоб величини R_s знаходились у межах 0,5—2.

 

ЗАСТОСУВАННЯ ТШХ ДЛЯ КОНТРОЛЮ ДОМІШОК У ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБАХ

Точність, яку може забезпечити людське око, становить ±20 %. У тому випадку, коли домішка з якихось Метод ТШХ застосовують для напівкількісної оцінки наяв­ності домішок у лікарських засобах. При цьому використовують три підходи: 1) метод мінімуму, що відкривається в умовах експе­рименту; 2) метод стандартних зразків речовин-свідків (СЗРС); 3) метод внутрішнього нормування.

1. Метод мінімуму, що відкривається в умовах експерименту. Попередньо встановлюють чутливість виявлення (мінімум) домі­шки при вибраних умовах хроматографування і детектування. Потім задають (виходячи з міркувань фармакології або технології) допустимий відсотковий вміст домішки в пробі (наприклад, не більш ніж 0,5 %). На хроматограму наносять таку кількість проби, щоб допустимий вміст домішки виявився нижчим від мінімуму, що від­кривається в умовах експерименту. При цьому на хроматограмі проби не повинна виявлятися пляма домішки (звичайно вказують приблизне значення її R_f). Наприклад, домішка має значення R_f близько 0,3, її мінімум, який можна відкрити, становить 0,2 мкг, допустимий вміст в основній речовині — не більше 0,5 %. Відпо­відно, при нанесенні на пластину 40 мкг основної речовини; на­ступному хроматографуванні і проявленні не повинна виявлятися пляма з R_f  близько 0,3.

Головний недолік методу — його суб’єктивність. Окрім того, мінімум, що відкривається, різниться на пластинах з різними сері­ями (партіями) одного і того ж сорбенту, а також дуже залежить від проявника.

Метод стандартних зразків речовин-свідків (СЗРС).За цим методом паралельно з пробою хроматографують розчини стандарт­них зразків речовин-свідків (СЗРС) у відповідному нанесенні. Величина та інтенсивність плям домішок у пробі не повинні пере­вищувати величину й інтенсивність відповідних плям СЗРС. Пе­реваги — найвища можлива в таких умовах об’єктивність (одночас­но перевіряються і величини R_f  домішок, тобто відбувається їх ідентифікація). Недолік — необхідність мати домішки у вигляді реактивів відомої чистоти, тобто з нормативною документацією, яка контролює їх якість. Ураховуючи, що домішки можуть бути самими різними, а потреба в них мала, розробляти кожний раз НТД на них не виправдано з економічних міркувань. Крім того, таким методом важко визначити загальний вміст домішок. Тому метод СЗРС застосовують, звичайно, тільки для контролю конк­ретних специфічних домішок, де він, унаслідок своєї об’єктивно­сті, найбільш бажаний.

Метод внутрішнього нормування. Найбільш поширений при контролі домішок як методом ТШХ, так і високоефективної рі­динної хроматографії (ВЕРХ) та газової хроматографії (ГХ). Особ­ливо він зручний при контролі загального вмісту домішок (хрома­тографічної чистоти). Його ідея полягає в перерахунку вмісту кожної домішки на основну речовину (концентрація якої звичай­но відома з точністю ±10 %). При цьому проба, що досліджуєть­ся, або відповідна субстанція (чи стандартний зразок) наносяться на хроматограму в декількох різних навантаженнях.

Для дослідження готують випробуваний і стандартний розчини. Зі стандартного розчину готують розведення, які дають можливість наносити проби, що становлять ОД; 0,5; 1 і 2 % відносно проби, що досліджується. Наносять на хроматограму певну кількість розчину, що досліджується, і стандартні розчини, хроматографують і прояв­ляють, як указано у відповідній монографії. На хроматограмі роз­чину, що досліджується, відмічають плями домішок і порівнюють їх відносну інтенсивність з відповідними плямами стандартного  розчину. Таким чином визначають вміст кожної домішки і їх загальний вміст у перерахунку на основну речовину. Загальний вміст домішок, як правило, не повинен перевищувати 2 %, якщо немає спеціальних указівок у монографії.

Перевага методу внутрішнього нормування — це можливість більш точно визначити вміст кожної домішки і, відповідно, всієї суми домішок, а також те, що цей метод не потребує використан­ня стандартів домішок.

Недоліком методу є те, що чутливість виявлення кожної домі­шки залежить як від величини R_f (а вони різні в домішки й осно­вної речовини), так і від її фізико-хімічних властивостей. Отрима­ні методом внутрішньої нормалізації результати завжди носять умовний характер і можуть бути далекими від справжніх значень. Однак вони можуть слугувати для стандартизації і контролю домі­шок, оскільки відтворюються в різних серіях лікарського засобу. Останніми роками розроблено лінійну, циркулярну й антициркулярну високоефективну тонкошарову хроматографію (ВЕТШХ). її створення стало можливим після отримання сорбентів з більш вузьким розподілом часток і пор, а також плівок, майже ідеально однорідних за товщиною. Оптимізація таких параметрів, як, на­приклад, середнє значення розмірів часток і ширина їх розподілу, дозволяє скоротити час аналізу, оскільки зростає швидкість проті­кання розчинника між частками і в середині пор. Як сорбенти використовують силікагель «Кизельгель 60» з величиною пор 6нм, целюлозу і т. ін.

Запропоновано метод ультрамікрохроматографії. Процес про­тікає в мікротонкому шарі спеціально приготовленого сорбенту, що різко підвищує швидкість і чутливість аналізу.

Для кількісного визначення речовин у суміші ТШХ застосову­ють разом із іншими методами. При цьому існує два варіанти ана­лізу: визначення речовини на самій хроматограмі і в елюаті. Оби­два часто використовують для аналізу лікарських форм. Важливі переваги порівняно із іншими комбінаціями фізико-хімічних ме­тодів аналізу має спільне застосування ТШХ з денситометричним визначенням.

 

ХРОМАТОГРАФІЯ НА ПАПЕРІ.

СПЕЦІАЛЬНІ ПРИЙОМИ ХРОМАТОГРАФІЇ

В ТОНКОМУ ШАРІ СОРБЕНТУ І НА ПАПЕРІ

Хроматографічний процес, що протікає на аркуші фільтруваль­ного паперу при переміщенні по його капілярах і поверхні рухо­мої рідкої фази, називається хроматографією на папері.

Нерухомою фазою є або сам папір, або речовини, попередньо нанесені на його волокна. Механізм хроматографії на папері може бути розподільчим або адсорбційним. Переміщення рухомої фази здійснюється або виключно під дією капілярних сил (висхідна, кругова хроматографії), або під дією капілярних сил і сили ваги (низхідна хроматографія).

Відтворність результатів аналізу в хроматографії на папері до­сягається при стандартизації таких чинників:

–         характеристика паперу для хроматографії;

–         конструкція і розмір камери;

–         склад нерухомої і рухомої фаз;

–         об’єм нанесеної проби;

–         характеристика стандартних речовин;

–         спосіб хроматографування (висхідний, низхідний та ін.);

–         ступінь насичення камери;

–         відстань, яку проходить рухома фаза;

–         спосіб виявлення речовин.

Кількісний вміст речовини методом хроматографії на папері можна встановити безпосередньо на хроматограмі, використовуючи, наприклад, планіметричний, денситометричний, люмінісцентний або інші методи. Для кількісної оцінки застосовують також спосо­би, які ґрунтуються на елююванні речовини, що досліджується, з вирізаної і подрібненої ділянки хроматограми. В елюаті або в су­хому залишку (після відгонки екстрагента) вміст речовини визна­чають методами, придатними для визначення малих кількостей речовин (спектрофотометрія, полярографія і т. ін.).

Хроматографію на папері широко застосовують для аналізу рослинної лікарської сировини і фітохімічних препаратів.

Останнім часом розроблено різноманітні варіанти, які дозво­ляють удосконалювати методи хроматографування в тонкому шарі сорбенту і на папері. Серед них слід відзначити такі, як повторне і двомірне хроматографування. Вони дозволяють досягти кращого розділення сумішей речовин, що аналізуються.

Повторне хроматографування полягає в тому, що після завер­шення першого хроматографування пластинку або папір висушують і піддають повторному пропусканню тієї ж або іншої рухомої фази в тому ж напрямку.

При двомірному хроматографуванні повторне пропускання тієї ж або іншої рухомої фази здійснюють у напрямку, перпендикулярному до первісного. Двомірне хроматографування доцільно здійснювати на квадратних пластинках або аркушах паперу. Пробу, що аналізується, при цьому наносять на діагональ квадрата поблизу одного з його кутів.

Двомірну хроматографію з використанням однієї і тієї ж рухо­мої фази часто застосовують для перевірки стійкості речовин в умовах хроматографування. Стійкі речовини утворюють плями, які лежать тільки на діагоналі пластинки або аркуша паперу.

 

 

РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ; ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ

ОСНОВИ МЕТОДУ

Рідинна хроматографія (РХ) — вид хроматографії, у якій рухо­мою фазою є рідина. Залежно від агрегатного стану нерухомої фази розрізняють адсорбційну (рідинно-твердофазну) і розподільчу (рідинно-рідкофазну) рідинну хроматографію. У фармацевтичному аналізі широкого застосування набуває високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).

ВЕРХ (рідинна хроматографія високого тиску) є варіантом ко­лонкової рідинної хроматографії, у якому рухома фаза — елюент — проходить через сорбент, що заповнює колонку, з великою швид­кістю за рахунок значного тиску на вході в колонку.

До ВЕРХ застосовуються всі кількісні співвідношення рідин­ної хроматографії. При використанні однакових сорбентів і рухо­мих фаз величини утримання в ТШХ (R_f ) можуть бути легко пере­раховані у величини утримання у ВЕРХ. Тому ТШХ іноді застосо­вуються для вибору рухомої фази у ВЕРХ.

Перевага ВЕРХ перед іншими методами — її універсальність і об’єктивність. Порівняно з ТШХ ВЕРХ має вищу ефективність розділення, а також дає можливість одержання кількісних, а не напівкількісних, як у ТШХ, результатів. ВЕРХ зараз є основним методом кількісного визначення у фармакопеї США, широко за­стосовується у Європейській, Британській, Німецькій фармакопеях і, в перспективі, може витіснити всі інші методи аналізу.

Головний недолік ВЕРХ — необхідність застосування дорогих стандартних зразків речовин-свідків, що збільшує вартість аналізу.

               Обладнання. Основні вузли сучасного хроматографа: насос ви­сокого тиску, дозатор, високоефективна колонка, детектор з при­строєм, що реєструє результати аналізу (рис 4.21)

Сучасні рідинні хроматографи сполучають з комп’ютерами або мікропроцесорами і споряджують пристроями, за допомогою яких можна автоматично проводити введення проби, підтримувати умови хроматографічного процесу за заданою програмою, автоматично оптимізувати умови розділення, проводити розрахунок кількісно­го складу суміші, що аналізується, за однією або декількома про­грамами і проводити якісний аналіз.

Насос високого тиску (до 200—500 атм) забезпечує подачу елю­енту в колонку з заданою постійною швидкістю. У деяких мікро-колонкових хроматографах застосовують насоси порівняно низь­кого тиску (до 10—20 атм).

Хроматографічні колонки виконують з нержавіючої сталі або скла довжиною 0,1—0,3 м, з внутрішнім діаметром 3—8 мм і запо­внюють сорбентом з діаметром часток 5—10 мкм сферичної або неправильної форми за допомогою суспензійно­го методу.

Щільне паку­вання часток адсорбенту малого діаметра дозволяє отримати високоефекти­вне хроматографічне роз­ділення компонентів су­міші.

Вид хроматографії, у якому як колонку вико­ристовують  капіляр дов­жиною 25—100 м і внут­рішнім діаметром 0,1 — 1 мм, виготовлений зі скла, міді, сталі, поліме­рів, внутрішня поверхня якого вкрита тонким шаром нерухомої рідкої фази, наприклад скваланом, називають капіляр­ною хроматографією. На таких колонках розділя­ють близькі за властиво­стями речовини.

Нерухома фаза. Як сорбенти у ВЕРХ застосовують матеріали на основі силікагелю, дуже рідко — на основі алюмінію окису. Останнім часом з’явилися полімерні сорбенти. Найбільш розповсюджені колонки, заповнені силікагелем з при­щепленими октадецилсилільними (С18) або октилсилільними (С8) групами. Прямофазні колонки на основі чистого силікагелю ви­користовують рідко. Це пов’язано з тим, що лікарські засоби, за­звичай, досить полярні речовини, більш рухомі на прищеплених (алкілованих) сорбентах. Іншою важливою причиною є те, що ви­користання прямофазних сорбентів (силікагелю) потребує за­стосування рухомих фаз, до складу яких належать органічні роз­чинники (етилацетат, ацетон, хлороформ і т. ін.), які інтенсивно поглинають в ультрафіолеті, що ускладнює застосування спектро­фотометричних детекторів.

У прищеплених сорбентів понад 50 % поверхні залишається незакритою, тому при аналізі дуже полярних сполук ці сорбенти проявляють прямофазні властивості. У такому разі значні елююючі властивості проявляє вода, неактивна у випадку малополярних речовин.

Тип прищепленого сорбенту визначається умовами поставле­ного завдання і пов’язується з рухомою фазою. В деяких випадках замість сорбентів з прищепленими С18-групами застосовують більш полярні сорбенти з прищепленими С8, С3, а також CN-групами.

Сорбенти одного і того ж типу виробництва різних фірм дещо відрізняються за хроматографічною поведінкою, що пов’язано з різним ступенем вкриття поверхні прищепленими групами і різ­ною питомою поверхнею підкладки. Тому при аналізі лікарського засобу бажано орієнтуватися на колонки якоїсь однієї фірми або в тексті монографії має бути передбачена процедура оптимізації умов аналізу.

Рухома фаза. На відміну від ТШХ, вибір рухомої фази у ВЕРХ досить обмежений. Як правило, це суміші вода — ацетонітрил або (рідше) вода — метанол, вода — тетрагідрофуран з модифікуючи­ми добавками (або без них) буферних або іон-парних реагентів. В останньому випадку використовують солі фосфатної, сульфат­ної або оцтової кислот, літію перхлорат, солі алкілсульфонових кислот і алкіламонію і т. ін. Прищеплені сорбенти на основі силі­кагелю чутливі до реакції середовища, тому рН рухомої фази має бути в межах 2,0—8,0. На прямофазних сорбентах (силікагелі) мо­жливе застосування більш кислих середовищ. Використання більш лужних рухомих фаз не бажане, бо може спричинити гідроліз при­щеплених алкільних груп. Небажане воно і на прямофазних сор­бентах, оскільки підвищує їх розчинність у рухомій фазі. Не реко­мендується також уведення до складу рухомої фази деяких іонів, наприклад хлорид-іонів, оскільки вони викликають корозію не­ржавіючої сталі колонок.

Уведення модифікуючих добавок має на меті зменшити вплив небажаних механізмів адсорбції або створити її певний механізм.

Можна виділити такі механізми:

–         режим пригнічення дисоціації слабких кислот (за допомо­гою кислих добавок);

–         іонообмінний механізм — добавки алкілсульфонатів або ал­кіл амонієвих солей; при цьому алкільні радикали сорбуються на прищепленій поверхні сорбенту, а іонна частина молекули в кон­такті з рухомою фазою виступає як іонообмінник;

–         іон-парний механізм — добавки літію перхлорату, солей алкіламонію, алкілсульфонатів і т. ін.

Очевидно, що ці механізми часто йдуть паралельно й одночас­но зі звичайною фізичною адсорбцією на поверхні сорбенту.

Питання оптимізації складу рухомої фази — одна з найбільш важких і ще не вирішених проблем рідинної хроматографії. Як загальний критерій необхідно враховувати, що об’єми утримання мають бути стійкими до незначних змін складу рухомої фази, в противному разі це призводить до невідтворності умов хроматографування.

Склад рухомої фази, зазначений у відповідній монографії, може або залишатися незмінним протягом усього аналізу (ізократичне елюювання), або змінюватися за заданою програмою (градієнтне елюювання). Градієнтне елюювання дозволяє значно скоротити загальний час аналізу за рахунок скорочення часу виходу сполук, які сильно утримуються колонкою; поліпшити розділення всієї суміші; поліпшити форму піка і зменшити «хвіст»; внаслідок неве­ликої відмінності у формі піків збільшує чутливість для ряду ком­понентів суміші, які виходять з колонки пізніше від інших.

Детектори. Як детектори в рідинній хроматографії звичайно використовують спектрофотометричний детектор з перемінною (190—900 нм) або фіксованою (найчастіше при 254 нм) довжиною хвилі, рефрактометричний або флуориметричний детектори. Мо­жуть бути використані й інші детектори, наприклад, іонізаційно-полуменевий, електрохімічні, мас-спектрометричний і т. ін.

При проведенні тестів «Контроль специфічних (конкретно вка­заних) домішок» і «Кількісне визначення», за інших рівних умов, доцільно застосовувати спектрофотометричний детектор з якомо­га більш специфічною довжиною хвилі детектування, щоб звести до мінімуму вплив на аналіз сторонніх речовин. Для цього довжи­ну хвилі доцільно вибирати в максимумі поглинання сполуки, що досліджується.

При проведенні тестів на хроматографічну чистоту («Звичайні домішки», «Хроматографічна чистота», «Споріднені сполуки» іт. ін.) доцільно вибирати якомога менш специфічну довжину хвилі детек­тування (190—220 нм), при якій інтенсивність поглинання різ­них сполук вирівнюється. При цьому зростають вимоги до чисто­ти (пропускання) рухомої фази. Під час розробки методики аналі­зу перевіряють стійкість до зміни аналітичної довжини хвилі детектування — при відхиленні на 2—4 нм результати не повинні сильно змінюватись. Отримані таким чином величини (внутрішня нормалізація) мають відносний характер (через відмінності коефі­цієнтів поглинання сполук, що досліджуються). У цілому, чим ме­нша довжина хвилі детектування, тим більш об’єктивні тести, що характеризують хроматографічну чистоту.

Недолік спектрофотометричного детектора — його недостатня універсальність: багато речовин (цукри, спирти, аліфатичні аміни і т. ін.) погано поглинають навіть у дальньому ультрафіолеті. У цьому випадку доцільно використовувати універсальний детек­тор — рефрактометричний. Однак, чутливість його на декілька по­рядків гірша від спектрофотометричного, що дуже обмежує його використання.

Вид хроматографії, у якому як детектор використовують мас-спектрометр, називають хромато-мас-спектрометрією.

 

КРИТЕРІЇ, ЩО ХАРАКТЕРИЗУЮТЬ ХРОМАТОГРАФІЧНИЙ ПРОЦЕС

До них належать такі критерії: утримання, ефективність і сту­пінь розділення, їх визначають за хроматограмою. Основною ха­рактеристикою речовини є об’єм утримання, який для і-того ком­понента розраховують за рівнянням:

де V_m = F*t_m — мертвий об’єм колонки, або об’єм утримання компонента, що не сорбується;

F — об’ємна швидкість рухомої фази;

t_m   — час утримання компонента, що не сорбується;

t_i   — час утримання і-того компонента;

К_i — константа розподілення, яка дорівнює відношенню кон­центрації і-того компонента в нерухомій і рухомій фазах;

V_s — об’єм нерухомої фази.

 

Більш об’єктивною величиною є виправлений об’єм утримання:

 

Для ідентифікації речовин користуються відносним об’ємом утримання r_i

де V _Rст  і t_ст— об’єм і час утримання стандартної речовини.

Для перевірки достовірності результатів аналізу використову­ють такі показники, як коефіцієнт симетрії піка, коефіцієнт розді­лення, число теоретичних тарілок, коефіцієнт ємності компонен­та та відношення сигнал/шум.

Однією з характеристик хроматограми є форма піка. Вона за­лежить від навантаження й умов хроматографування (вибору не­рухомої фази, складу і швидкості руху рухомої фази). При правиль­ному виборі умов хроматографування утворюються симетричні піки. В адсорбційній хроматографії іноді спостерігається утворення піків з «хвостом». Для розподільчої хроматографії в разі перевантажен­ня колонки характерне утворення піків з крутим заднім фронтом. Утворення «хвостів» може спостерігатися також при малій швид­кості масопередачі з нерухомої фази. Для перевірки правильності вибору умов хроматографування визначають коефіцієнт симетрії піка (рис. 4.22), який обчислюють за формулою:

де b_0.05 — ширина піка на 1/20 його висоти;

А — відстань між перпендикуляром, опущеним з максимуму піка, і переднім краєм піка на 1/20 його висоти.

Мета хроматографії — розділення за прийнятний проміжок часу компонентів суміші на окремі смуги (піки) в міру їх просування колонкою.

Розділення двох сусідніх піків характеризується коефіцієнтом розділення (R_s) (рис. 4.22), який може бути обчислений за форму­лою:

де t _Ra і t_Rb  — відcтані вздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикулярів, опущених з максимумів двох сусідніх піків, мм;

 b_0.5a і b_0.5b — ширина піків на половині висоти, мм.

 

Якщо немає інших указівок у монографіях, результати аналізу вважаються достовірними, коли коефіцієнт розділення для піків, що вимірюються на хроматограмі, більший 1,0.

Ефективність колонки кількісно виражається числом теоретич­них тарілок (n), яке може бути обчислене з даних, отриманих в ізократичному режимі, за формулою:

де t_R — відстань уздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, опущеного з максимуму піка речо­вини, що аналізується, мм;

b_0.5 — ширина піка на половині висоти, мм.

Число теоретичних тарілок характеризує ефективність розді­лення, яке визначається відносним розмиванням хроматографіч­них зон у колонці. По суті проводиться порівняння ширини піка з часом перебування компонента в колонці. Чим ефективніша ко­лонка, тим менше розмивання смуг (тобто утворюються вужчі піки).

Як характеристику ефективності колонки використовують та­кож висоту, еквівалентну теоретичній тарілці (ВЕТТ), яку розра­ховують за формулою:

де L — довжина хроматографічної колонки.

Коефіцієнт ємності k’ (відомий також  як коефіцієнт розподілу маси D ) визначають як:

 

де К — рівноважний коефіцієнт розподілу, який дорівнює від­ношенню концентрації речовини, що аналізується, в не­рухомій фазі до її концентрації в рухомій фазі;

V_s, Vm — об’єм нерухомої і рухомої фаз відповідно. Коефіцієнт ємності компонента може бути також визначений з даних хроматограми (рис. 4.22) за формулою:

де t_R — відстань уздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, опущеного з максимуму піка компо­нента, що аналізується, мм;

t_R`— відстань уздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, опущеного з максимуму піка компо­нента, що не сорбується, мм.

Малі значення k’ показують, що компоненти слабко утриму­ються колонкою й елююються близько від піка речовини, яка ко­лонкою не утримується. При цьому спостерігається погане розді­лення. Якщо значення k’ великі, розділення поліпшується, однак зростає час аналізу і піки стають широкими, що ускладнює їх ви­значення.

 Під час запису хроматографічного процесу навіть у холостому досліді або до чи після появи піка, як правило, самописець фіксує не пряму, а певну хвилясту лінію. Це так званий «шум». Поява шумів може бути викликана, наприклад, утворенням бульбашок газів у детекторі при певному зниженні тиску або підвищенні тем­ператури. У деяких випадках шум може виникати в процесі підси­лення сигналу детектора або в роботі самого самописного при­строю. Гранично допустимий рівень шумів регламентують відно­шенням сигнал/шум (S/N), яке розраховують за формулою:

 

де h  — висота піка відповідного компонента на хроматограмі, отриманій для вказаного розчину порівняння;

h_n — абсолютне значення найбільшої флуктуації шуму від ба­зової лінії на хроматограмі контрольного розчину, яке спостерігається на проміжку, рівному двадцятикратній ширині на половині висоти піка, розміщеному рівномір­но навколо місця розташування піка.

ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

Перед початком досліджень хроматограф має бути перевіре­ний за відповідною методикою, згідно з якою на стандартній ко­лонці і наборі речовин-свідків (фенілалкілкетонів) перевіряються метрологічні характеристики відтворності об’єму утримання, ви­соти і площі піків — як у варіанті абсолютних величин, так і при внутрішньому нормуванні.

Відносні стандартні відхилення для об’ємів утримання площ і висот піків, якщо немає інших указівок у відповідних монографі­ях, не повинні перевищувати відповідно 1,5; 5; 4 %. Відносні стан­дартні відхилення для відношень об’ємів утримання, площ і висот піків так само не повинні перевищувати відповідно 0,75; 2,5; 1,5%.

Ураховуючи нестандартність сорбентів, відмінність однотипних сорбентів у різних фірм, а також зміну їх характеристик у процесі експлуатації, у тексті методик газової хроматографії (ГХ) і ВЕРХ у НТД обов’язково повинен бути тест «Придатність системи», згід­но з яким мають заздалегідь оцінюватися: відтворність відгуку (пло­щі, висоти піка, відношення висот або площ), коефіцієнт розділення піків, фактор асиметрії, а також інші величини, наприклад, ефек­тивність колонки (число теоретичних тарілок п) за якимось конк­ретним піком. Для визначення цих величин готується спеціальний розчин. Розрахунок проводиться за результатами п’яти повторних вимірювань.

У тексті методики ВЕРХ, що вводиться до НТД, повинні бути такі розділи і відомості:

– тип сорбенту, його зерніння; колонка, її розміри, матеріал;

– тип детектора та його параметри (для спектрофотометрич­ного детектора вказують довжину хвилі детектування);

– склад рухомої фази, її швидкість;температура колонки (в сучасних хроматографах вона регу­люється);

– оцінка придатності системи: допустиме число теоретичнихтарілок, розділення тестових піків, фактор асиметрії, ефективністьколонки по тестовій речовині (число теоретичних тарілок), стандарт­не відхилення відтворності відгуку, співвідношення сигнал/шум;

– докладний опис методики і формули розрахунку.

У примітки виносяться приготування рухомої фази, розчинів стандартів і тестових розчинів.

 

КОРЕКТУВАННЯ ХРОМАТОГРАФІЧНИХ УМОВ

Під час проведення хроматографічного дослідження допуска­ється коректування хроматографічних умов, зазначених у відповід­ній монографії, яке виконують для досягнення придатності систе­ми. У межах цих змін методика була валідована при її розробці. Тести на придатність системи включають у методику для забезпе­чення необхідної якості хроматографії (розділення, форма піка, збіжність результатів). Однак, оскільки нерухома фаза описана в статті в загальному вигляді, є багато комерційне доступних сорбен­тів указаного типу з дещо відмінними властивостями, для досяг­нення вимог щодо придатності системи може знадобитися корек­тування хроматографічних умов. Іноді, зокрема для оберненофазної хроматографії, воно не завжди призводить до досягнення необхідних вимог. У такому разі слід замінити колонку на анало­гічну, але з іншою комерційною маркою сорбенту, який забезпе­чує виконання необхідних умов.

Для критичних параметрів рекомендації з їх регулювання з метою досягнення виконання вимог щодо придатності системи чітко обумовлюються у відповідній монографії.

Слід уникати одночасної зміни декількох умов аналізу, коли це може справити кумулятивний ефект на систему.

Склад рухомої фази: концентрація мінорного розчинника може бути змінена на ±30 % відносних або ±2 % абсолютних залежно від того, який вираз більший. Для інших компонентів концентра­ція може бути змінена на ± 10 % абсолютних.

рН водних компонентів рухомої фази: ±0,2 одиниці рН; при ана­лізі нейтральних речовин ±1,0 одиниці рН.

Концентрація солей у буферному розчині, який уходить до складу рухомої фази: ±10 %.

Коректування довжини хвилі детектування не допускається.

Колонка: довжина ±70 %; внутрішній діаметр ±25 %; розмір частинок не більше 50 % у бік зменшення; не допускається збіль­шення частинок.

Швидкість рухомої фази: ±50 %.

Об’єм введеної проби може бути зменшений за умови вико­нання вимог щодо детектування піка і збіжності результатів.

Програма градієнта: конфігурація обладнання, що використо­вується, може суттєво впливати на ступінь розділення, час утри­мання і відносний час утримання, описані в методиці. На ці пара­метри впливає об’єм комунікацій, тобто об’єм між точкою змі­щення компонентів рухомої фази і колонкою.

                              

ЗАСТОСУВАННЯ ВЕРХ

При контролі якості лікарських засобів ВЕРХ застосовується в тестах «Ідентифікація», «Контроль специфічних домішок», «Хро­матографічна чистота», «Розчинення», «Однорідність дозування» і «Кількісне визначення». Усі тести, крім «Ідентифікації», є, фактич­но, варіантами «Кількісного визначення».

Методика проведення ідентифікації за допомогою ВЕРХ, на відміну від ТШХ, досить проста: порівнюються абсолютні або від­носні (стосовно вибраного внутрішнього стандарту) об’єми утри­мання сполук, що досліджуються, у випробуваній пробі і стандарт­ному зразку.

Кількісний аналіз методом ВЕРХ ґрунтується на припущенні, що площі (або висоти) піків, які відповідають індивідуальним спо­лукам на хроматограмі, пропорційні їх кількості або концентрації. Площини піків S нa хроматограмі вимірюють за допомогою плані­метра, інтеграторів площини піків, зважуванням вирізаних піків або обчислюють за такими формулами:

де S — площа піка;

h   — висота піка;

b   — ширина основи піка;

b_0.5 — ширина піка на середині висоти.

Кількісний вміст речовини можна визначити декількома спо­собами:

 Метод абсолютного градуювання. За результатами серії аналі­зів будують графік залежності площі (або висоти) піка від вмісту речовини в пробі g_i., г. За результатами аналізу визначають площу (висоту) піка, по градуювальному графіку — вміст речовини в пробі й розраховують відсотковий вміст речовини в наважці.

Метод внутрішнього стандарту. Аналізують суміш невідомого складу, до якої вводять відому кількість речовини — внутрішнього стандарту, яка не міститься в пробі. Вміст і-того компонента, %,
розраховують за формулами:

де К_ст , S_ст , h_ст — калібрувальний коефіцієнт, площа та висота піка

речовини;

r — відношення маси внутрішнього стандарту до маси речо­вини, що аналізується.

Коефіцієнти K_is, K_ih, K_{ct(s h}} (т/см2) розраховують за формулами:

3. Метод нормування. Суму всіх площ (висот) піків на хроматограмі приймають за 100 %. Вміст i-того компонента розраховують як відсоток від загальної суми площ. Для проведення розрахунку кількісного складу цим методом необхідно, щоб на хроматограмі були зареєстровані всі компоненти, які входять до складу суміші, що аналізується.

Кількісний аналіз бажано провести методом внутрішнього стан­дарту. Останнім часом провідні фірми, що виробляють рідинні хроматографи, добилися високої відтворності об’ємів утримання, висот і площ піків, що дозволяє в багатьох випадках виключити застосування внутрішнього стандарту і використовувати пряме градуювання у варіанті методу стандарту.

Рідинний хроматограф „Міліхром-5”

 

 

 

 

 

 

 

 

ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФІЯ

ОСНОВИ МЕТОДУ

Газова хроматографія — це хроматографія, у якій рухома фаза знаходиться в стані газу або пари. У фармацевтичному аналізі за­стосовується як газоадсорбційна, так і газорідинна хроматографія. У газоадсорбційній хроматографії нерухомою фазою є твердий адсорбент, а в газорідинній — рідина, нанесена на твердий носій.

Через систему впродовж усього досліду пропускається газ-носій. Речовина, що аналізується, вводиться в потік газу-носія, ви­паровується і в пароподібному стані проходить крізь колонку, де й розділяється на компоненти. Розділені речовини елююються по­током газу-носія, реєструються детектором і фіксуються на хрома­тограмі у вигляді піків. Отримана хроматограма є основою для якісного і кількісного аналізу суміші речовин. Метод газової хро­матографії застосовується для аналізу летких речовин або речо­вин, які можуть бути переведені в леткі за допомогою спеціальних прийомів, а також летких продуктів піролізу речовин, що дослі­джуються (піролітична хроматографія).

Газовий хроматограф складається з систем: введення, вимірю­вання та регулювання швидкості потоку газу-носія і допоміжних (для детектора) газів; уведення проби зразка, що аналізується; газохроматографічних колонок; термостатування і контролю темпе­ратури колонок; детектування, реєстрації й обробки хроматогра­фічної інформації (рис. 4.23).

 

 

Рис. 4.23. Принципова схема газового хроматографа:

/ — балон із газом-носієм; 2 — пристрій для регулювання тиску і складу газової суміші; 3 — детектор; 4 — термостат; 5 — колонка; 6 — пристрій для введення проби; 7 — самописець; 8 — хроматограма

Газ-носій подається в хроматограф з балона через редуктор. Найчастіше застосовують гелій, азот, аргон. Система введення проби складається з випарника, який має забезпечити якомога швидше випаровування компонентів проби і мембрани з термо­стійкої гуми. Об’єм проби рідини складає 0,1 — 1 мкл, газу — 0,5— 5 мл. Газохроматографічну колонку виготовляють зі скла або не­ржавіючої сталі у вигляді прямої, спіральної чи U-подібної трубки довжиною 1—3 м і внутрішнім діаметром 0,6—5 мм.

Температура колонки має забезпечити оптимальне розділення компонентів суміші. Для аналізу сумішей із широким діапазоном температур кипіння компонентів доцільно використовувати газо­ву хроматографію з програмуванням температури або витрати газу-носія, або сполучення цих видів газової хроматографії. Найбільш розповсюджені тверді носії на основі силанізованого силікагелю, кремнезему, фторвуглецевих полімерів, полістиролу і його співпо­лімерів. Нерухомою рідкою фазою є рідина з високою температу­рою кипіння. Найчастіше використовують полісилікони, поліетиленгліколі, вазелінове масло, апієзони, прості і складні ефіри, поліфеніли, багатоатомні спирти і т. ін.

              Автоматична система вимірювання, реєстрації та обробки хрома­тографічної інформації включає в себе детектор, електронні при­строї підсилення, самописний вимірювальний прилад та інтегра­тор.

Найрозповсюдженішим детектором є детектор за іонізацією полум’я, котрий має досить високу чутливість і універсальність при аналізі органічних сполук. Недолік цього індикатора — склад­ність роботи на ньому, оскільки він вимагає застосування трьох газів: газу-носія (краще гелій або ксенон), водню (з балонів або гідролітичного) і повітря (з балонів або компресора). Крім того, він не чутливий до молекул неорганічних сполук (вода, гази), а також органічних сполук, у молекулах яких відсутні групи С—Н. У такому разі доцільно застосовувати значно простіший у роботі детектор за теплопровідністю (катарометр), який є універсальним індикатором, але має слабшу чутливість.

 ЗАСТОСУВАННЯ ГАЗОВОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

У зв’язку з широким розповсюдженням ВЕРХ газова хромато­графія в контролі якості лікарських засобів останнім часом вико­ристовується в основному для контролю залишкових розчинни­ків, де вона поза конкуренцією.

Цей розділ найбільш докладно розроблений у Фармакопеї США (USP XXIII), де є відповідна загальна стаття “Organic volatile impurities” («Леткі органічні домішки»). Згідно з нею методики визначення летких органічних домішок мають уводитися до всіх монографій на лікарські засоби. Виняток складають лише ті випад­ки, коли виробник, виходячи зі схеми технологічного процесу та умов зберігання, може довести відсутність у лікарському засобі токсичних розчинників і відповідність їх вмісту вимогам загальної статті.

В USP XXIII (с. 3352) описано шість методів визначення залиш­кових розчинників, які відрізняються умовами приготування і вве­дення проб, колонками, нерухомими і рухомими фазами, газом-носієм, умовами проведення хроматографування, детектором. За цією статтею перевіряють наявність бензолу, хлороформу, 1,4-діок-сану, хлористого метилену і трихлоретилену. Крім того, в USP XXIII (с. 1747) подається також метод визначення метиленхлори­ду в таблетках, покритих оболонкою.

На базі цих статей Державним науково-експертним центром лікарських засобів (ДНЦЛЗ) розроблено проект загальної статті Фармакопеї України.

Останнім часом газова хроматографія використовується для ідентифікації лікарських засобів тоді, коли вона ж застосовується і для кількісного визначення. При цьому порівнюється відносний час утримання (стосовно внутрішнього стандарту) речовини, що досліджується, у пробі й стандарті. Наприклад, у препараті «Фіцилін» методом газової хроматографії ідентифікують фторотан, цик­логексан, бутилацетат (внутрішній стандарт — толуол) і ментол (внутрішній стандарт — додеканол). Одночасно методом внутріш­нього нормування проводять кількісне визначення цих речовин. Вміст речовин в одній ампулі, г, розраховують, використовую­чи як розрахунковий параметр висоту піка за формулою:

де h_x — висота піка речовини, що визначається, мм;

h_ст — висота піка внутрішнього стандарту;

К_х — розрахунковий коефіцієнт для речовини, що визначаєть­ся;

а   — теоретична кількість речовини, що визначається.

Розрахунковий коефіцієнт визначають за результатами аналізу спеціально приготованої модельної суміші за формулою:

Як і у випадку ВЕРХ, газова хроматографія використовується в тестах «Однорідність дозування», «Розчинність», «Кількісне визна­чення». Основне застосування в кількісному визначенні лікарських засобів вона знаходить в аналізі розчинників, а також консерван­тів — компонентів лікарських засобів, зокрема етанолу, пропанолу, хлорбутанолу, гліцерину, димексиду, фенолу, парабенів і т. ін.

 

 

 

 

 

Газовий хроматограф „Цвет -800”

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Газовий хроматограф Focus GC Thermo Finnigan

 

АНАЛІЗ АМПІЦИЛІНУ НАТРІЄВОЇ СОЛІ

Ідентифікація (1998 – EUROPEAN PHARMACOPOEIA)

Тест В. Дослідження проводять методом хроматографії в тон­кому шарі сорбенту, використовуючи пластини, вкриті силанізованим силікагелем HR.

Розчин, що досліджується. Розчиняють 25 мг субстанції, що досліджується, в 10 мл розчину натрію гідрокарбонату R.

Еталонний розчин (а). Розчиняють 25 мг стандартної субстанції ампіциліну тригідрату CRS в 10 мл розчину натрію гідрокарбона­ту R.

Еталонний розчин (Ь). Розчиняють 25 мг стандартної субстанції амоксициліну тригідрату CRS і 25 мг стандартної субстанції ампі­циліну тригідрату CRS у 10 мл розчину натрію гідрокарбонату R.

Наносять окремо на пластинку по 1 мкл кожного розчину. Проводять хроматографування, доки фронт розчинників пройде 15 см; як хроматографічну систему використовують суміш 10 об’­ємів ацетону R, 90 об’ємів 154 г/л розчину амонію ацетату R, дове­деного до відповідного рН 5 мл льодяної оцтової кислоти R. Вису­шують пластинку на повітрі й проявляють парами йоду до появи плям. Основна пляма на хроматограмі розчину, що досліджується, має бути схожою за положенням, кольором і розміром з основною плямою на хроматограмі еталонного розчину (а). Тест вважається незадовільним, якщо на хроматограмі еталонного розчину (Ь) не буде чітко видно дві окремі плями.

Супутні сполуки. Визначення проводиться рідинною хромато­графією (1998 – EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2.2.29), як опи­сано в розділі «Кількісне визначення». Вводять у колонку 50 мкл розчину (d) і елююють до тих пір, поки не вийде пік ампіциліну. Вводять у колонку 50 мкл розчину (Ь), що досліджується, і почи­нають ізократичне елюювання. Після того, як вийде пік ампіцилі­ну, негайно починають лінійне градієнтне елюювання, як указано в табл. 4.1. Якщо рухома фаза була приготована з дотриманням необхідних умов, нульова лінія з початком лінійного градієнтного елюювання не повинна зазнавати істотних змін.

 

Час, хв	Рухома фаза А, %, за об’ємом	Рухома фаза В, %, за об’ємом	Коментарі
0-30	85 ->0	15 → 100	лінійний градієнт
30-45	0	100	ізократично
45-60	85	15	промивання колонки

 

Уводять рухому фазу А й повторюють елюювання, щоб отри­мати стабільну нульову лінію. Вводять у колонку еталонний роз­чин (е) й елююють, як описано вище. На хроматограмі, отриманій для еталонного розчину (е), знаходять піки ампіциліну й димеру, час утримання якого складає 2,8 відносно ампіциліну. На хрома­тограмі, отриманій для розчину, що досліджується (???Ь), в будь-яко­му випадку площа піка димеру не повинна більш як у 4,5 раза перевищувати площу основного піка на хроматограмі, отриманій для еталонного розчину (d) (4,5 %). Будь-які інші піки до уваги не беруться.

Метиленхлорид. Не більш як 0,2 % (за масою) визначають га­зовою хроматографією (1998 — EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2.2.28), використовуючи етиленхлорид як внутрішній стандарт.

Розчин внутрішнього стандарту. Розчиняють 1 мл етиленхлориду R у воді R і розбавляють до 500 мл тим же розчинником.

Розчин, що досліджується (а). Розчиняють 1 г речовини, що досліджується, у воді R і розбавляють до 10 мл тим же розчинни­ком.

Розчин, що досліджується (b). Розчиняють 1 г речовини, що досліджується, у воді R, додають 1 мл розчину внутрішнього стан­дарту і розбавляють до 10 мл водою R.

Еталонний розчин. Розчиняють 1 мл метиленхлориду R у воді R і розбавляють до 500 мл тим же розчинником. До 1 мл розчину додають 1 мл розчину внутрішнього стандарту і розбавляють до 10 мл водою R.

Процес хроматографування може бути проведений з викорис­танням:

—   скляної колонки довжиною 1,5 м і внутрішнім діаметром 4 мм, спорядженої кремнеземом R для газової хроматографії(diatomaceous earth for gas chromatography R), обробленим 10 %-вим розчином macrogol 1000 R;

—   азоту для хроматографії R як газу-носія при швидкості по­току 40 мл за 1 хв;

—   полуменево-іонізаційного детектора.

Підтримують температуру в колонці 60, в інжекторі — 100, в детекторі — 150 °С. Вміст метиленхлориду розраховують, прийма­ючи його густину при 20 °С за 1,325 г/мл.

Кількісне визначення. Проводиться рідинною хроматографією (1998 – EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2.2.29).

Розчин, що досліджується (а). Розчиняють 31 мг речовини, що досліджується, в рухомій фазі А і розбавляють до 50 мл рухомою фазою А.

Розчин, що досліджується (b). Готують безпосередньо перед використанням. Розчиняють 31 мг речовини, що досліджується, в рухомій фазі А і розбавляють до 10 мл рухомою фазою А.

Еталонний розчин (а). Розчиняють 27 мг безводного ампіцилі­ну CRS у рухомій фазі А і розбавляють до 50 мл рухомою фазою А.

Еталонний розчин (b). Розчиняють 2 мг безводного цефрадину CRS у рухомій фазі А і розбавляють до 50 мл рухомою фазою А. До 5мл розчину додають 5 мл еталонного розчину (а).

Еталонний розчин (с). Розбавляють 1 мл еталонного розчину (а) до 20 мл рухомою фазою А. Розбавляють 1 мл розчину до 25 мл рухомою фазою А.

Еталонний розчин (d). Розбавляють 1 мл еталонного розчину (а) до 20,0 мл рухомою фазою А.

Еталонний розчин (е). До 0,20 г речовини, що визначається, додають 1 мл води R. Нагрівають розчин при 60 °С протягом 1 год. Розбавляють 0,5 мл розчину до 50 мл рухомою фазою А.

Хроматографічне визначення може бути проведене з викорис­танням:

– колонки довжиною 0,25 м і внутрішнім діаметром 4,6 мм, спорядженої октадецилсиланізованим силікагелем для хромато­графії R (5 мкм);

– рухомої фази зі швидкістю потоку 1 мл за 1 хв:

         1) рухома фаза А. Суміш 0,5 мл розведеної оцтової кисло­ти R, 50 мл 0,2 моль/л калію дигідрофосфату і 50 мл ацето-нітрилу R, розведена до 1000 мл водою R;

        2) рухома фаза В. Суміш 0,5 мл розведеної оцтової кисло­ти R, 50 мл 0,2 моль/л калію дигідрофосфату і 400 мл ацетонітрилу R, розведена до 1000 мл водою R;

—      спектрофотометричного детектора при 254 нм. Промивають колонку рухомою фазою в співвідношенні А: В 85:15 (до встановлення рівноваги між рухомою фазою і сорбен­том)*. Уводять еталонний розчин (b). Визначення вважається не дійсним, якщо на отриманій хроматограмі розділення між двома основними піками (ампіцилін і цифрадин)* не досягає 3,0. У разі необхідності змінюють співвідношення А:В у рухомій фазі. Коефі­цієнт ємності компонента для першого піка (ампіцилін) має зна­ходитись у межах від 2,0 до 2,5. Вводять 50 мкл еталонного розчи­ну (с). Підбирають систему таким чином, щоб отримати хромато­графічний пік зі співвідношенням сигнал/шум щонайменше 3,0. Вводять еталонний розчин (а) шість разів. Випробування вважа­ється не певним, якщо відносне середнє квадратичне відхилення площі основного піка перевищує 1 %. Вводять поперемінно роз­чин (а), що досліджується, та еталонний розчин (а).

Розраховують вміст ампіциліну натрієвої солі шляхом множення відсоткового вмісту ампіциліну на 1,063 (метод абсолютного нор­мування)*.