Заняття 3

Матеріали для підготовки до практичного заняття №3

для студентів 2 курсу медичного факультету

спеціальність «Здоров’я людини»

 

1. Екологія мікроорганізмів. Методи визначення санітарно-показових бактерій довкілля. Вплив чинників середовища на мікроорганізми. Методи стерилізації, дезінфекції та їх контролі. Мікрофлора людини та її дослідження.

2. Хіміопрепарати. Антибіотики. Основні принципи раціональної хіміотерапії інфекційних хвороб. Методи визначення антибіотикочутливості бактерії.

 

 

Мікроорганізми повсюдно поширені у навколишньому середовищі. Вони є в грунті, воді, повітрі, на рослинах, харчових продуктах, предметах, в організмі людини і тварин. На відміну від рослин і тварин, мікроорганізми можуть використовувати в процесах метаболізму метан, водень, молекулярний азот, окис вуглецю і перетворювати їх у сполуки, що засвоюються рослинами і тваринами. Так, наприклад, гнильні мікроорганізми, розщеплюючи загиблі рослини і трупи тварин, повертають в атмосферу 90 % вуглекислого газу, який поглинається  рослинами.

У кругообігу азоту беруть участь азотфіксуючі бактерії родів Phizobium, Azotobacter, деякі актиноміцети, синьо-зелені водорості та ін. У грунті відбуваються процеси амоніфікації (гниття білків з утворенням аміаку) і нітрифікації (окислення солей амонію в азотнокислі сполуки, що забезпечує рослини легко засвоюваними сполуками азоту); під впливом денітрифікуючих бактерій (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa та ін.) здійснюється денітрифікація – розкладання азотно- й азотистокислих солей з виділенням вільного азоту, в результаті чого збе­рігається рівновага між вмістом молекулярного азоту в атмосфері і  зв’язаним  азотом  грунту, рослин і тварин.

Процеси розпаду безазотистих речовин називаються бродінням. Розрізняють бродіння спиртове (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces el lipsoides та ін.), маслянокисле (Clostridium butyricum.Clostridium lactis та ін.), молочнокисле (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis та ін.) і бродіння пептинових речовин (Flavobacterium pectinovorum та ін.). Названі реакції беруть участь у кругообігу вуглецю.

Кругообіг сірки, фосфору і заліза здійснюється сіркобактеріями, залізобактеріями та іншими видами мікроорганізмів.

Ферментативна активність мікроорганізмів забезпечує звільнення поверхні Землі від загиблих рослин і тварин, а також від екскрементів тварин і людини; вони мінералізуються з утворенням вуглекислого газу, аміаку, води, азотистої, азотної, сірчаної і фосфорної кислот, що використовуються в природі для синтезу складних органічних  сполук.

Як показник загального рівня бактеріального обсіменіння грунту, води, повітря, харчових продуктів, оточуючих предметів використовують мікробне число (загальна кількість мікроорганізмів в 1 мл досліджуваної рідини, 1 г твердої речовини, 1 м³ повітря, на 1 м² поверхні площі досліджуваного об’єкта або субстрату), яке визначають методом прямого підрахунку під мікроскопом або за допомогою мембранних.

Загальний рівень бактеріального забруднення і кількість санітарно-показових мікроорганізмів (бактерії групи кишкових паличок, ентерококи, стафілококи, стрептококи, термофіли) є непрямими показниками ймовірності потрапляння у навколишнє середовище патогенних   видів.

Мікрофлору навколишнього середовища вивчає санітарна мікробіологія, завданнями якої є: розробка методів мікробіологічних і вірусологічних досліджень грунту, води, повітря, предметів побуту, харчових продуктів та ін.; вивчення джерел забруднення навколишнього середовища мікрофлорою, що становить небезпеку для людини; дослідження життєдіяльності мікроорганізмів у навколишньому середовищі, особливо в умовах його хімічного і біологічного забруднення; визначення нормативів для гігієнічної оцінки об’єктів навколишнього середовища, в тому числі харчових продуктів (за мікробіологічними показниками); обгрунтування заходів для оздоровлення об’єктів навколишнього середовища і контроль за ефективністю їх виконання (якість водопостачання, робота підприємств харчової промисловості і громадського харчування, знезаражування стічних вод,  покидьків та ін.)

Складні взаємозв’язки мікроорганізмів із середовищем, які зумовлюють їх розмноження, розвиток і виживання, вивчає спеціальна біологічна наука екологія. Розрізняють екологію популяцій і екологію угруповань. Вивчення екології мікроорганізмів є основою для розуміння явищ паразитизму, механізму виникнення зоонозних захворювань, особливо тих, що характеризуються природною вогнищевістю, а також для розробки практичних заходів у боротьбі з різними   інфекційними   захворюваннями

 

Мікрофлора грунту

Учення про грунт створили С. М. Виноградський, В. В. Докучаев, П. А. Костичев, В. Р. Вільямс та інші вчені. Родючість грунту залежить не тільки від наявності неорганічних та органічних речовин, а й від різних видів мікроорганізмів, що зумовлюють якісний склад грунту. У грунті є необхідні для розвитку бактерій поживні ре­човини і волога, внаслідок чого їх кількість в 1 г грунту досягає величезних кількостей: від 200 млн у глинястому грунті до 5 млрд у чорноземному. В 1 г орного шару грунту міститься 1—10 млрд бактерій.

Мікрофлора родючого грунту складається з популяцій водоростей, актиноміцетів, нітрифікуючих, денітрифікуючих, целюлозорозкла-даючих бактерій, сіркобактерій, пігментних мікроорганізмів, грибів і найпростіших. Особливо велике значення мають азотфіксуючі бактерії, які можуть жити не тільки в коренях бобових, а й на тютюнових рослинах. У збагаченні грунту азотом важливу роль відіграють синьо-зелені водорості. Ступінь обсіменіння грунту мікроорганіз­мами залежить від його характеру та хімічного складу.

Найбільше (1 000 000 в 1 мм³) бактерій у верхньому шарі грунту— на глибині 5—15 см. У глибоких шарах (1,5—6 м) трапляються одиничні особини; їх виявлено і в артезіанській воді. У родовищах нафти живуть нафтові бактерії. Живлячись парафінами (відходи нафти), вони перетворюють частину нафти в густу асфальтоподібну масу, вна­слідок утворення якої закупорюються природні резервуари нафти. В орному шарі окультуреного грунту товщиною 15 см на площі 1 га може бути 5—б т бактеріальної маси

Основні представники мікрофлори грунту:

Нітрифікуючі, денітрифікуючі, азотфіксуючі бактерії, сірко-, залізобактерії, гриби, найпростіші.

 

З виділеннями людей і тварин у грунт попадають і деякий час там зберігаються збудники правця, газової гангрени, ботулізму, сибірки, черевного тифу, дизентерії, холери, окремі віруси.

Обсіменіння грунту мікроорганізмами залежить від ступеня забруднення його фекаліями і сечею, а також від характеру обробітку та удобрення. Наприклад, в орному шарі грунту в 2,5 раза більше мікроорганізмів, ніж у лісовому. У грунті довго зберігаються спори сапрофітів (В. cereus, В. megaterium та ін.).

Патогенні, що не утворюють спор, бактерії внаслідок нестачі потрібних поживних речовин, а також в результаті згубної дії світла, висихання, бактерій-антагоністів і фагів зберігаються у грунті від кількох діб до кількох місяців.

У здійсненні профілактичних заходів санітарна мікробіологія враховує властивість багатьох видів ґрунтових бактерій (В. subtilis, В. brevis, В. thermophilus та ін.) пригнічувати ріст і розмноження патогенних   і   умовно-патогенних   мікроорганізмів.

Звичайно грунт є несприятливим середовищем для більшості патогенних видів бактерій, вірусів, грибів, найпростіших. Проте як фактор передачі низки збудників інфекційних захворювань він відіграє важливу роль

Відбір проб грунту проводять у 4-5 точках вибраної ділянки на глибині 10-15 см. Лопатою викопують ямки глибиною 20 см. Над однією з бокових стінок ямки за допомогою пропаленого на вогні ножа зрізають верхній шар грунту. В стерильну банку беруть по 200-300 г із кожної точки, змішують, відбирають наважку в 30 г і вносять у колбу, що містить 300 см³ стерильної води. Суміш ретельно збовтують на протязі 10 хв, потім відстоюють 2-3 хв для осідання грубих частинок.

При необхідності брати пробу з глибших шарів грунту використовують спеціальний земляний бур Некрасова, який дає змогу відбирати проби на заданій глибині.

Із отриманої суспензії готують серійні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-6 і більше. По 1 см³ із останніх двох розведень вносять на дно двох стерильних чашок Петрі й заливають 15 см³ розтопленого й охолодженого до 45 °С МПА. Після застигання середовища чашки інкубують 48 год при 28-30°С. Із суми колоній, що виросли на двох чашках одного розведення, вираховують середнє арифметичне й визначають ЗМЧ. Наприклад: посіяно 1 см³ суспензії грунту з розведення 10⁴; на чашці з агаром виросло в середньому 70 колоній; отже ЗМЧ = 70 х 10⁴ = 7 х 10⁵ бактерій.

При визначенні титру БГКП по 1 см³ різних розведень грунту засівають у 9 см³ глюкозо-пептонного або лактозо-пептонного середовища. В разі розкладу вказаних цукрів до кислоти й газу висів роблять на середовище Ендо, темно-червоні колонії, що виросли, мікроскопують, ставлять пробу на оксидазу й вираховують титр БГКП так само, як і для води.

Титр ентерококів визначають шляхом посіву відповідних розведень на середовище Каліни або ДИФ-3; перфрінгенс-титр вираховують посівом розведень суспензії на середовище Вільсона-Блера; кількість грибів – на середовище Сабуро, актиноміцетів – на крохмально-аміачний агар. Для визначення титру термофільних бактерій різні розведення суспензії грунту вносять у чашки Петрі, заливають розтопленим і охолодженим МПА. Посіви інкубують 24 год при 60 °С, підраховують кількість вирослих колоній і роблять перерахунок на 1 г грунту.

Оцінку ступеня забруднення грунту проводять шляхом визначення загального мікробного числа й кількісного аналізу основних індикаторних мікроорганізмів                                                                                                          

Санітарно-мікробіологічна оцінка грунту

 

Санітарно-показові бактерії грунту: кишкова паличка, ентерокок, Clostridium perfringens – показники фекального забруднення і термофільні мікроорганізми.

Колі індекс – кількість бактерій групи кишкової палички в 1 г грунту

Грунт вважається чистим, якщо його колі-індекс не перевищує 1000.

 

Мікрофлора води

1. автохтонна – актиноміцети, мікрококи, псевдомонади, спірохети, непатогенні вібріони;

2. заносна, при забрудненні водоймищ стічними водами – кишкові палички, ентерококи, клостридії, спірили, вібріони, ентеровіруси, ротавіруси.

 

Мікрофлора води річок залежить від ступеня їх біологічного забруднення та якості очистки стічних вод, які спускають у русла річок.

Мікроорганізми дуже поширені також у водах морів і океанів, де їх виявляли на різних глибинах (3700—10 000 м). До них належать галобактерії (рід Halobacterium) і галококи (рід Halococcus), які адаптувались до існування в умовах високих концентрацій солей. Галобактерії і галококи — хеморганотрофи, аероби, плеоморфні мік­роорганізми, утворюють пігменти різного кольору, індол, сірководень, оксидазу, каталазу, розріджують желатину.

Із морської води прибережної зони систематично висіваються галофільні вібріони — V. parahaemolyticus, V. angilolyticus, які спричинють у людей гострий гастроентерит, що виникає в результаті вживання у їжу малосольної риби, а також недостатньо термічно оброблених креветок і мідій.

Ступінь обсіменіння води організмами прийнято виражати сапробністю, під якою розуміють сукупність живих істот, які живуть у водах з великим скупченням тварин або рослинних решток. Розрізняють чотири зони сапробності.

Полісапробна зона— дуже забруднена вода, бідна на кисень і багата на органічні сполуки. Кількість бактерій в 1 мл доі сягає 1 млн і більше, переважають Е. соїі та анаеробні бактерії, які спричинюють процеси гниття і бродіння.

У мезосапробній зоні (зона помірного забруднення) мінералізуються органічні речовини з інтенсивним окисленням і вираженою нітрифікацією. Кількість бактерій в 1 мл становить сотні тисяч.

Олігосапробна зона характерна для чистої води. Кількість бактерій у ній незначна, в 1 мл налічується кілька десятків або сотень:; Е. соlі у цій зоні немає.

Катаробна зона— зона дуже чистої води (особливо в осінньо-зимовий період), вона розташована вдалині від населених пунктів і берегів.

Санітарно-показові бактерії води: кишкова паличка, ентерокок, Clostridium perfringens – показники фекального забруднення.

 

Мікробіологічні показники безпеки питної води

(Наказ МОЗ України від 23.12.1996 р.)

 

Визначення ЗМЧ – по1 мл води різних розведень засівають у розтоплений і охолоджений МПА на чашках Петрі.

 

Визначення БГКП проводять за методом мембранних фільтрів або за методом бродильних проб.

До категорії БГКП належать бактерії родини Enterobacteriaceaе, що об’єднує роди Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це грамнегативні, безспорові, оксидазонегативні палички, які ферментують глюкозу і лактозу до кислоти й газу при 37 °С. Вони виділяються в зовнішнє середовище з випорожненнями людей і теплокровних тварин і є кількісним показником ступеня фекального забруднення води. Тому чим більше її фекальне забруднення, тим вища ймовірність контамінації води відповідними патогенними мікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних бактерій, а в ній – фекальні кишкові палички (ФКП), які розкладають лактозу при 44,5 °С. До E.coli відносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником свіжого фекального забруднення. Для його визначення можна використати S.faecalis, який порівняно швидко гине в оточуючому середовищі.

При повноцінному санітарно-мікробіологічному дослідженні води визначають ЗМЧ, БГКП, E.coli, ентерококи, стафілококи, патогенні мікроорганізми (холерні вібріони, сальмонели, шигели, лептоспіри, ентеровіруси та ін.).

Взяття проб води. Для проведення мікробіологічного аналізу відбирають 500 см³ води у стерильні флакони, закриті ватно-марлевою пробкою, покритою зверху паперовим ковпачком. Взяття проб з водопровідних кранів проводять після обпалювання їх спиртовим факелом і наступного випускання води на протязі 10 хв. Проби хлорованої води беруть у флакони з дехлоратором (на 500 см³ води 2 см³ 1,5 % розчину гіпосульфіту натрію, простерилізованого в автоклаві).

Якщо дослідження проводять на виявлення не лише індикаторних а й патогенних мікроорганізмів, потрібно брати пробу об’ємом 2500 см³ води. Коли визначають ще й індекс коліфагів об’єм проби збільшують до 3500 см³.

У відкритих водоймах проби беруть за допомогою батометра.

Визначення загального мікробного числа води. Цей показник визначає кількість мезофільних, мезотрофних аеробів і факультативних анаеробів, які виростають на МПА при 37 °С протягом 24 год. Залежно від ступеня ймовірного бактерійного забруднення воду сіють із таким розрахунком, щоб на агарі в чашках виростало від 30 до 300 колоній. Звичайну водопровідну або артезіанську воду сіють у нерозведеному стані в об’ємі 1 см³. Проби з відкритих водойм, криниць, джерел і т.п. сіють після попереднього їх розведення від 10^-1 до 10^-3 і більше (особливо стічних вод). Для цього в ряд пробірок наливають по 9 мл стерильної води, в першу з них вносять 1 см³ досліджуваної води, ретельно перемішують, із цієї пробірки переносять 1 см³ у другу, потім у третю і всі наступні по 1 см³ попереднього розведення. Для виготовлення кожного розведення необхідно брати нову стерильну піпетку.

Нерозведену або розведену воду в об’ємі 1 см³ вносять, рівномірно розкапуючи, на дно стерильної чашки Петрі, потім заливають її 10-12 см³ розтопленого й охолодженого до 45 °С м’ясо-пептонного агару. Обережними круговими рухами змішують воду з агаром. Як правило, сіють не менше двох розведень і для кожного з них використовують дві чашки. Після застигання середовища посіви вирощують у термостаті при 37°С протягом 24 год. Через добу підраховують число колоній у двох чашках і знаходять середнє арифметичне. При значній кількості колоній підрахунки проводять за допомогою спеціального приладу АПК (апарат для підрахунку колоній). Методика користування ним регламентована спеціальною інструкцією.

Відповідно до існуючих вимог звичайна водопровідна вода може містити не більше 100 мікробів. ЗМЧ відкритих водойм і криничної води не повинно перевищувати 1000.

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок. Цей показник (індекс БГКП) визначають за допомогою методу мембранних фільтрів і бродильним методом. Мікробіологічні лабораторії частіше використовують метод мембранних фільтрів. Він значно простіший і дає стабільні результати.

Метод мембранних фільтрів. Сутність методу полягає в концентруванні бактерій з певного об’єму досліджуваної води на мембранний фільтр, вирощуванні на середовищі Ендо при 37 °С і підрахунку індексу БГКП в 1 дм³ води.

При аналізі водопровідної води необхідно фільтрувати не менш як 333 см³. При дослідженні води невідомої якості слід фільтрувати менші об’єми: наприклад 3, 30, 100, 200 см³.

Промисловість випускає нітроцелюлозні мембранні фільтри під 6 номерами: чим менший номер, тим дрібніший діаметр пор. Для дослідження води використовують фільтри № 2 і № 3. Їх вміщують у підігріту до 80 °С дистильовану воду і ставлять на слабкий вогонь до закипання. Кип’ятять тричі по 15 хв, кожного разу замінюючи воду. Після останнього кип’ятіння воду не зливають, фільтри залишають в ній до вживання.

Для фільтрування води використовують апарат Зейтца або прилад Рубльовської водопровідної станції.

Прилади оптирають ватним тампоном, змоченим спиртом, і фламбірують. Після охолодження їх монтують на колбі Бунзена. На нижню частину апарата (столик) кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний фільтр, прижимають його верхньою частиною приладу (стакан, воронка) і закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією. У воронку (стакан), дотримуючись правил асептики, наливають досліджуваний об’єм води й за допомогою масляного насоса створюють вакуум у колбі Бунзена. Після закінчення фільтрування знімають воронку (стакан), мембранний фільтр беруть обпаленим на вогні пінцетом і вміщують на середовище Ендо так, щоб між агаром і фільтром не було бульбашок повітря. В одній чашці Петрі можна розмістити 3-4 фільтри. Чашки з фільтрами на середовищі Ендо вміщують у термостат догори, інкубують при 37°С протягом 18-24 год.

Рис. Визначення колі-титру та колі-індексу води

(метод мембранних фільтрів).

 

Рис. Мікроорганізми на фільтрі (метод мембранних фільтрів).

Електронна фотографія.

 

Облік результатів проводять через добу. При відсутності будь-яких колоній або при рості лише плівчастих, зубчастих та інших колоній, не властивих для ешеріхій, видають негативний результат. Якщо виростають типові для коліформних бактерій колонії, з них виготовляють мазки. У випадках виявлення грамнегативних паличок залишок колонії пересівають у глюкозо-пептонне середовище й при позитивній бродильній пробі присутність БГКП вважають позитивною. Дослідження закінчують постановкою проби на оксидазу. Для цього знімають фільтр і кладуть його колоніями на фільтрувальний папір, змочений реактивом на виявлення оксидазної активності. При наявності оксидази колонії забарвлюються у синій колір. Коліформні бактерії не утворюють оксидази.

 

Мікрофлора повітря

Мікрофлора повітря дуже різноманітна. Склад її залежить від ступеня забрудненості повітря мінеральними й органічними зависями, температури, осадів, характеру місцевості, вологості та інших факторів. Чим вища концентрація у повітрі пилу, газів, кіптяви, тим більше в ньому бактерій. Кожна частинка пилу або диму може адсорбувати їх на своїй поверхні.

Над поверхнею гір, арктичних морів, океанів мікроорганізми трапляються рідко.

Мікрофлора повітря складається із найрізноманітніших видів мікроорганізмів, які надходять у нього з грунту, рослин і живих організмів. У повітрі часто трапляються пігментні сапрофітні бактерії (мікрококи, різні сарцини), В. subtilis, В. megaterium, В. cereus, актиноміцети,  плісеневі, дріжджові гриби та ін.

Кількість бактерій у повітрі коливається у великих діапазонах від кількох особин до багатьох десятків тисяч екземплярів в 1 м³. Так, наприклад, у повітрі Арктики міститься 2—3 особини на 20 м³; у промислових містах в 1 см³ повітря виявляється величезна кількість бактерій. У лісі, особливо хвойному, бактерій у повітрі дуже мало, бо на них згубно діють леткі речовини рослин — фітонциди, що мають бактерицидні властивості. Над Москвою на висоті 500 м в 1 м³ по­вітря було виявлено 1100—2700 бактерій, тоді як на висоті 2000 м — від 500 до 700. Спороносні види і плісеневі гриби було виявлено на висоті 20 км. Деякі мікроорганізми виявляють і на висоті 61—77 км. В 1 г пилу є до 1 млн. бактерій.

Залежно від пори року якісний і кількісний склад мікрофлори повітря змінюється. Якщо взяти загальну кількість мікроорганізмів у повітрі взимку за 1, то весною вона становитиме 1,7, влітку — 2, восени — 1,2

 

Основні представники мікрофлори повітря: актиноміцети, сарцини, мікрококи, бацили, гриби.

Патогенні мікроорганізми попадають в повітря від хворого і можуть тимчасово там знаходитись – збудники дифтерії, туберкульозу, коклюшу, скарлатини, менінгіту, ангіни, грипу, кору, аденовірусних інфекцій тощо.

Санітарно-показові мікроорганізми повітря: гемолітичні стрептококи і золотисті стафілококи.

Оцінку чистоти повітря закритих приміщень проводять на основі визначення загальної кількості мікробів в 1 м³  і наявності санітарно-показових бактерій. З цією метою проби повітря відбирають седиментаційним або аспіраційним методами.

 

Кількість мікроорганізмів у робочих і жилих приміщеннях тісно пов’язана з санітарно-гігієнічним режимом. При скупченні людей, поганій вентиляції, слабкому природному освітленні, неправильному прибиранні приміщень кількість мікроорганізмів значно збільшується. Сухе прибирання, рідке миття підлоги, використання брудних ганчірок і щіток, сушіння їх у тому ж приміщенні створюють сприятливі умови для нагромадження в повітрі мікроорганізмів.

Віруси можуть розповсюджуватися повітряно-пиловим і повітряно-краплинним шляхом. При чханні, кашлі, розмові хвора людина виділяє у навколишнє середовище на відстань 1—1,5 м і більше разом з краплинками слизу, мокротиння патогенні віруси.

Мікроорганізми, що є в повітрі, можуть бути у трьох фазах бактеріального аерозолю — краплинній, краплинно-ядерній і пиловій. Під аерозолем розуміють фізичну систему із дрібних твердих або рідких часточок, що зависли в газовому середовищі.

Людина вдихає за добу в середньому 12 000—14 000 л повітря, причому 99,8 % мікроорганізмів, що є в ньому, затримуються в дихальних шляхах. Бактеріальний аерозоль (до 60 000 краплин різного розміру), що утворюється природним шляхом у просторі носової частини глотки, при чханні і кашлі виділяється в повітря.

Найбільше бактерій виділяється при чханні, менше — при кашлі, ще менше — при розмові. Характер бактеріального аерозолю залежить від в’язкості секрету, що виділяється з дихальних шляхів. Рідкий секрет подрібнюється на менші краплинки легше, ніж в’язкий. Біля бактеріовиділювача утворюється найбільш концентрований аерозоль, що складається з бактеріальних краплин розміром від 1 до 2000 мкм. Величина основної маси краплин коливається від 2 до 100 мкм. Крупні краплини величиною від 100 до 2000 мкм виділяються на відстань 2—3 м і більше і швидко осідають. Дрібні краплинки бактеріального аерозолю (1—10 мкм) можуть довго (протягом кількох годин і діб) бути в завислому стані.

Повітря — несприятливе середовище для бактерій і вірусів. Відсутність поживних речовин, вологи, оптимальної температури, згубна дія сонячного проміння і висушування не створюють умов для їх збереження. Однак і порівняно короткого перебуванням мікроорганізмів у повітрі цілком досить для того, щоб зумовити передачу патогенних видів мікроорганізмів від хворих осіб здоровим. Через повітря можуть передаватися разом з краплинами слизу й мокротиння при чханні, кашлі, розмові збудники хвороб — скарлатини, дифтерії, коклюшу, стафілококової, стрептококової і менінгококової інфекцій, ангіни, туберкульозу, гострого сальмонельозного гастроентериту, грипу, кору, натуральної і вітряної віспи, герпесу, епідемічного паротиту, краснухи, аденовірусних та інших захворювань. Повітряно-пиловим шляхом розповсюджуються спори сибірки, правця, гісто-плазмозу, грибів, збудники Ку-гарячки, орнітозу та ін.

 

Критерії оцінки мікробного забруднення повітря в приміщеннях лікарні

 

Санітарно-бактеріологічне дослідження повітря проводять у плановому порядку в дитячих закладах, лікарняних палатах, операційних, пологових залах тощо. При цьому визначають загальну кількість бактерій в 1 м3 повітря і наявність санітарно-показових мікроорганізмів (гемолітичних, стрептококів і золотистих стафілококів). Проби повітря відбирають седиментаційним або аспіраційним методами.

 

Седиментаційний метод Коха використовують для визначення мікрофлори повітря закритих приміщень. Для цього чашки Петрі з МПА або спеціальними середовищами для стафіло- і стрептококів залишають відкритими у місцях взяття проб. Строки експозиції залежать від гаданого мікробного забруднення повітря: при великій кількості бактерій чашки відкривають на 5-10 хв, при малій – на 20-40 хв. Після експозиції чашки закривають і вміщують у термостат при 37 °С на 18 год, а потім ще добу витримують при кімнатній температурі. Підраховують кількість колоній і визначають число бактерій в 1 м3 повітря. За даними В.Л. Омельського, на площу в 100 см2 за 5 хв осідає стільки бактерій, скільки їх міститься в 10 л повітря.

Наприклад, на чашці з агаром при 5 хв експозиції виросла 21 колонія. Площа стандартної чашки Петрі складає біля 70 см2. Отже, на 100 см² виросло б 21·100:70=30 колоній, тобто та кількість бактерій, яка міститься в 10 л повітря. Отже, в 1 м3 їх буде 30·1000:10=3000.

Аспіраційний метод грунтується на ударній дії повітряного струменя об поверхню живильного середовища і прилипанні до нього бактерій. Дослідження проводять за допомогою апарата Кротова (Рис. 2). Повітря в кількості 100-250 л пропускають зі швидкістю 25 л/хв через клиноподібну щілину над чашкою з живильним середовищем. Електромотор приладу обертає чашку з постійною швидкістю, що рівномірно розподіляє втягнуті через щілину бактерії на всій площі середовища. Засіяну чашку інкубують при 37 °С протягом доби і ще 24 год при кімнатній температурі, підраховують кількість колоній. Знаючи об’єм пропущеного через апарат повітря і число колоній, легко вираховують кількість мікробів в 1 м³. Видову характеристику мікрофлори визначають після макро- і мікроскопічного дослідження колоній, виділення чистих культур і їх ідентифікації звичайними методами. Державних стандартів для оцінки бактеріального забруднення повітря ще не розроблено. Прийняті лише тимчасові допустимі норми кількості санітарно-показових бактерій в 1 м³ повітря лікарняних приміщень.

 

Рис. Колонії бактерій на МПА                              Рис.  Аппарат Кротова

                                                                                                                     після посіву мікрофлори повітря

                                                                                                                     седиментаційним методом.

 

Апарат Кротова складається з пристрою для відбору проб повітря, ротаметра, який регулює швидкість і кількість всмоктуваного повітря, та електромотора. Прилад включають у електромережу, знімають кришку, на спеціальний диск закріплюють відкриту чашку Петрі з живильним середовищем. Рукою надають їй інерційного руху за годинниковою стрілкою, закривають кришку апарата і включають мотор. Чашка обертається з постійною швидкістю 60 об/хв. Повітря із заданою швидкістю втягується через клиноподібну щілину плексигласової пластини, що закриває чашку Петрі з агаром. При цьому частинки аерозолю з мікроорганізмами рівномірно прилипають до живильного середовища. При дослідженні загального мікробного числа пропускають, як правило, 100 дм³ повітря зі швидкістю 25 дм³/хв. Якщо визначають кількість індикаторних бактерій (золотисті стафілококи, альфа- і бетта-гемолітичні стрептококи) об’єм досліджуваного повітря збільшують до 300-500 дм³. Після взяття проби чашку з посівом повітря знімають, закривають її, й інкубують 18-24 год при 37 °С і ще 24 год при кімнатній температурі.

Розрахунок загального мікробного числа проводять за формулою:

          

   а • 1000

X = –––––––––––,

  V

де    а – кількість колоній, що виросли в чашці Петрі,

        V– об’єм пропущеного через прибор повітря в дм³,

        1000 – заданий об’єм повітря для визначення ЗМЧ.

 

Приклад розрахунку: через прилад пропущено 100 дм³ повітря; число колоній, що виросли – 370. Отже кількість мікроорганізмів у 1 м³ повітря буде дорівнювати:

370 х 1000

X = –––––––––––– = 3700.

100

 

Фільтраційний метод. Для його використання запропоновані спеціальні прилади: Дяконова, Речменського, Кіктенко, ПАБ-1, ПОВ-1 та ін. Принцип їх дії зводиться до пропускання певного об’єму повітря через рідину в приладі (або фільтр) з наступним висівом мірної кількості її на живильні середовища. При застосуванні фільтрів їх накладають на щільне живильне середовище. Підраховують число колоній, що виросли, та проводять відповідні перерахунки на весь об’єм рідини в приладі й визначають число мікроорганізмів у 1 м³ повітря.

За допомогою цього методу можна провести дослідження повітря на присутність і тих патогенних мікроорганізмів, які не культивуються на живильних середовищах. Рідину, що поглинула бактерійні аерозолі повітря, можна використати для зараження лабораторних тварин або проведення спеціальних бактеріологічних та вірусологічних досліджень.

Безпосереднє виявлення патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів (стафілококи, стрептококи, псевдомонади, інші грамнегативні бактерії), які викликають госпітальні інфекції, проводять при аналізі повітря хірургічних, акушерсько-гінекологічних та інших стаціонарів.

При виникненні внутрішньолікарняних інфекцій, спричинених стафілококами, проводять дослідження на виявлення джерела й шляхів їх розповсюдження. При цьому визначають ідентичність культур, виділених із повітря, інших об’єктів оточуючого середовища, а також від хворих і медичного персоналу за допомогою фаготипування.

Державні стандарти для оцінки санітарно-бактеріологічних показників повітря ще не розроблені. Запропоновані лише тимчасові положення про допустиме нормування мікробного забруднення окремих лікарняних та інших приміщень. Так, у повітрі операційних, родильних залів, реанімаційних, перев’язувальних і процедурних загальна кількість бактерій в 1 м³ до роботи не повинна перебільшувати 500, після роботи – 1000; кількість S.anreus не більше 4, а гемолітичних стрептококів взагалі не повинно бути. У повітрі лікарняних палат взимку ЗМЧ не повинно перевищувати 3500, S.aureus – до 24, а гемолітичних стрептококів не більше 24. Влітку ці показники не повинні перевищувати відповідно 5000, 52 і 36.

 

Мікробіоценоз, біотоп, екологічна ніша.

Популяція – су купність особин одного виду, які проживають у певному біотопі.

Біотоп – ділянка обмеженої території з однорідними умовами існування.

Мікробіоценоз – сукупність популяцій мікроорганізмів, які проживають в одному біотопі.

Екосистема – система, в яку входять біотоп і мікробіоценоз.

Біосфера – жива оболонка землі, загальна сума всіх екосистем.

 

Мікрофлора людини

Мікрофлора організму людини є результатом взаємного пристосування мікроорганізмів і макроорганізму в процесі еволюції. Більша частина бактерій постійної мікрофлори організму людини пристосувалась до життя у певних його відділах. Крім того, є мікроорганізми, що становлять непостійну (випадкову) мікрофлору.

Постійна (резидентна) – мікрофлора специфічна для даного біотопу (автохтонна).

Тимчасова – мікрофлора занесена з інших біотопів хазяїна (алохтонна),

                        мікрофлора занесена з інших біотопів довкілля (заносна).

 

Важливою особливістю нормальної мікрофлори є її індивідуальність й анатомічна стабільність.

Із розвитком вірусології і вдосконаленням вірусологічної техніки розширились уявлення про мікрофлору організму людини. Доведено, що не тільки відкриті порожнини, а й тканини людського організму заселені персистуючими вірусами, які виділяються у навколишнє середовище з молоком, слиною, мокротинням, потом, сечею, калом.

 

Основні представники мікрофлори різних відділів тіла людини.

Мікрофлора шкіри: коринебактерії, пропіонібактерії, стафілококи, мікрококи, сарцини, актиноміцети, плісневі й недосконалі гриби, мікобактерії, стрептококи, кандіди.

На поверхні шкіри живуть сардини, плісеневі ї дріжджові гриби, непатогенні коринебактерії та умовно-патогенні бактерії (стафілококи, стрептококи). Живлення їх забезпечується виділеннями жирових і сальних залоз, відмерлими клітинами і продуктами розпаду. На поверхні шкіри в однієї людини виявляли від 85 млн до І млрд особин мікроорганізмів.

При стиканні тіла людини з грунтом її одяг і шкіра обсіменяються спорами різних видів мікроорганізмів (клостридії правця, анаеробної інфекції та ін.). Найчастіше забруднюються відкриті частини людського тіла, головним чином руки. На їх поверхні виявляють Е. соlі стафілококи, стрептококи, плісеневі, дріжджові і недосконалі гриби, спори аеробних і анаеробних бацил.

Порушення санітарно-гігієнічного режиму, нормальних умов праці і побуту людей нерідко є причиною виникнення гнійних захворювань шкіри або мікозів.

Рис. Електронна фотографія мікрофлори шкіри

 

Матеріал для дослідження із здорової чи патологічно зміненої шкіри найчастіше беруть стерильним ватним тампоном (див. змиви з рук). Він дає змогу провести лише якісний аналіз мікрофлори, що вегетує на поверхні шкіри.

Для повсякденної діагностичної роботи використовують кількісний метод Н.Н. Клемпарської і Г.А. Шальнової. За цим методом на поверхню звичайних предметних скелець наносять розплавлені кров’яний агар, середовища Ендо і Коростильова (на 100 см³ агару 1 г маніту і 0,3 см³ 1 % водного розчину бромтимолового синього, стерилізують 20 хв при 115 °С. Предметними скельцями із застиглими середовищами роблять посіви-відбитки на ділянці шкіри, яку попередньо ретельно протирають 0,25 % розчином аміаку для видалення поверхневої мікрофлори, яка не має діагностичного значення. Скельця вміщують у чашки Петрі для попередження висихання агару й інкубують при 37 °С протягом 24 год. Підраховують кількість всіх колоній на кров’яному агарі (окремо із зоною гемолізу), відсоток жовтих (манітпозитивних) колоній на середовищі Коростильова, кількість колоній ентеробактерій на середовищі Ендо. Знаючи площу скельця, вираховують кількість колоній (а отже й бактерій) на 1 см² шкіри.

Для більш точного дослідження мікрофлори шкіри використовують метод змивів-зіскобів Вільямсона і Клігмана в модифікації С.І. Ситника. За допомогою цього методу можна визначити абсолютне число мікроорганізмів на досліджуваній ділянці шкіри. Для цього на поверхню шкіри прикладають і щільно притискають стандартний стерильний скляний циліндр із шліфованими краями, площа перерізу якого становить точно 1 см², а висота 5 см. У нього вносять 1 см³ 0,1 % розчину тритону Х-100 в 0,075 М фосфатному буфері рН 7,9. Потім в циліндр опускають стерильний стальний робочий елемент масою 18 г, який має на торці дрібні насічки, які роблять зіскоб епітелію і мікрофлори. Робочий елемент обертають руками без натиску протягом 1 хв. Змивну рідину відсмоктують стерильною пастерівською піпеткою в пробірку. В циліндр, ще притиснутий до шкіри, повторно вносять 1 см³ розчину тритону і процедуру змиву повторюють. Обидві змивні рідини змішують і з суміші готують десятикратні розведення (10^-0, 10^-1, 10^-2, 10^-3) в 0,05 % розчині тритону для попередження реагрегації бактерій. По 0,1 см³ нерозведеної, а також розведених проб засівають на селективні живильні середовища (кров’яний агар; ЖСА, фуразолідоно-твіновий агар, середовища Гарро, Ендо, Сабуро, кров’яний агар ВВL для анаеробів – до стандартного середовища ВВL додають 5 % дефібринованої крові барана). Посіви інкубують при 37 °С протягом 48-96 год. Підраховують кількість колоній, що виросли, користуючись лупою або приладом ПСБ. Результати виражають числом КУО на 1 см² шкіри за формулою:

 

число КУО = 20 · m · n,

 

де 20 – постійний коефіцієнт при посіві 0,1 см³ проби,

m – число колоній, що виросли,

n – розведення (в 10, 100, 1000 разів).

 

У відповіді для лікаря вказують загальне мікробне обсіменіння досліджуваної ділянки: високе – понад 10⁶, середнє – 10³-10⁵, низьке – менше 10³ КУО/см²; види виділених мікроорганізмів; стан мікробіоценозу (еубіоз, дисбактеріоз).

 

Мікрофлора ротової порожнини: різні види стрептококів, пептококів, вейлонел, бактероїдів, лактобактерій, лептотриксів, фузобактерій, актиноміцетів, спірохет та інші .

 

Рис.  Мікрофлора ротової порожнини в тушовому препараті.

 

У порожнині рота є сприятливі умови для життя мікроорганізмів. Слина — важливий поживний субстрат. У ній є амінокислоти, білки, ліпіди, вуглеводи, неорганічні речовини.

Через кілька годин після народження дитини бактерії можуть розможуватися в порожнині рота, і через кілька діб там виявляють окремі види стрептококів, нейсерій, актиноміцетів, лактобактерій та ін. Кількісний і якісний склад мікрофлори порожнини рота залежить від характеру харчування та віку дитини.

У порожнині рота постійно живе S. salivarius, якому властивий тропізм до поверхні органів порожнини рота, особливо багато його на поверхні язика.

Більшість видів мікроорганізмів порожнини рота — аероби й факультативні анаероби. Під час прорізування зубів з’являються облігатні грамнегативні анаероби. У збереженні мікроорганізмів у порожнині рота важливу роль відіграють глікопротеїди слини, які зумовлюють нагромадження певних бактерій на поверхні зубів, що прорізуються

Бактеріологічні дослідження вмісту ротової порожнини проводять з метою вивчення етіології патологічних процесів слизової, ясен, зубів, діагностики ряду специфічних захворювань (сифіліс, туберкульоз, ангіна Симановського-Плаута-Венсона, ВІЛ-інфекція), при виготовленні нових матеріалів для протезів та пломбування зубів. Його треба проводити до початку лікування хіміопрепаратами, до вживання їжі й не раніше, ніж через 4-5 год після місцевого лікування.

Матеріалом для дослідження є полоскальний змив, зубний наліт, біоптати слизової щік і язика, вміст каріозних зубів і гангренозних пульп. Найчастіше його беруть ватним тампоном, яким обтирають слизову щік, ясен, язика, мигдалики. В разі виявлення ясневих карманів чи виразок мазок треба брати ще одним тампоном або платиновою петлею, а при ушкодженні зубних каналів – стоматологіччним зондом, обгорнутим стерильною ватою або окремими ватними чи паперовими гнотиками. Слину забирають з-під язика. У зв’язку із зростаючим поширенням СНІДу взяття матеріалів для бактеріологічного чи вірусологічного дослідження треба проводити з максимальною обережністю, щоб виключити зараження інших пацієнтів.

При бактеріоскопії мазки забарвлюють за методом Грама або Романовського-Гімзи. Спірохети виявляють у нативних препаратах за допомогою темного поля, фазовоконтрастного чи аноптрального мікроскопів.

Бактеріологічне дослідження проводять шляхом посіву матеріалу на елективні та диференціальні середовища для аеробних і анаеробних мікроорганізмів із врахуванням біологічних особливостей вказаних вище родів і видів бактерій, грибів і найпростіших. Виділені культури ідентифікують за їх морфологічними, культуральними, ферментативними та антигенними властивостями.

Висновок про роль того чи іншого збудника у виникненні карієсу, гінгівіту, пульпіту, парадонтозу та інших патологічних процесів роблять не лише на основі визначення виду а й щільності його популяції. Частіше всього вказані захворювання викликає не один вид, а різноманітні асоціації мікроорганізмів.

 

Мікрофлора шлунка і кишок: шлунок – спорові та лактобактерії, дріжджі, сарцини; кишечник – біфідо- і лактобактерії (верхні відділи), анаероби – біфідобактерії, клостридії, бактероїди, лактобактерії, вейлонели (нижні відділи).

 

Таблиця. Бланк бактеріологічного дослідження фекалій

 

Мікрофлора дихальних шляхів: дифтероїди, стафілококи, нейсерії, стрептококи, пептококи.

Разом з повітрям людина вдихає величезну кількість частинок пилу й адсорбованих на них мікроорганізмів. Дослідним шляхом доведено, що кількість мікроорганізмів у повітрі, яке ми вдихаємо, у 200—500 раз більша, ніж у тому, яке видихаємо. Більшість їх затримується у порожнині носа і лише не-вэлика частина проникає в бронхи. Кінцеві розгалуження бронхів і альвеоли легень звичайно стерильні. У верхніх дихальних шляхах (носова частина глотки, зів) є кілька відносно постійних видів бактерій (стафілококи, стрептококи, непатогенні коринебактерії, пептококи та  ін.).

При ослабленні захисних сил організму в результаті охолодження, вясначоння, нестачі вітамінів бактерії, які постійно перебувають у дихальних шляхах, стають здатними спричиняти гострі респіраторні захворювання, ангіну, пневмонію, бронхіт та ін. Слизова оболонка носа продукує муцин і лізоцим, які мають захисну дію. У порожнині носа є й секреторні антитіла. Однак, незважаючи на це, мікрофлора порожнини носа відносно стала — гемолітичний, або носовий, мікрокок, непатогенні коринебактерії, стафілококи, стрептококи, сапрофітні грамнегативні диплококи, капсульні грамнегативні бактерії, Haemophilus influenzae, протей та ін. Крім бактеріальної мікрофлори, у дихальних шляхах протягом тривалого часу можуть зберігатися, не спричиняючи патологічних процесів, багато вірусів, зокрема аденовіруси

Матеріал для дослідження повинен брати спеціаліст, оскільки вірний забір має вирішальне значення для виявлення епідеміологічно значущих мікроорганізмів.

Слиз (секрет) із носа беруть натще або через 2 год після вживання їжі й до початку лікування стерильними ватними тампонами, виготовленими краще з негігроскопічної вати. Для кожного носового ходу використовують окремий тампон. Матеріал із носоглотки беруть спеціальним задньоглотковим тампоном, який вводять через зів або носовий отвір у носоглотку. Матеріал із ротоглотки забирають одним тампоном. Спочатку обтирають ним правий мигдалик, потім дужку піднебіння, язичок, ліву дужку й лівий мигдалик. Важливо слідкувати, щоб тампон не торкався слизової щік і язика. В разі виявлення чітко локалізованого патологічного осередку матеріал із нього необхідно взяти окремим тампоном. Зеленячі стрептококи частіше виявляють у слині, яку беруть з-під язикової ямки.

При ураженні нижніх дихальних шляхів і легень досліджують харкотиння. Останнім часом широко використовують більш точні аспіраційні методи при бронхоскопії та пункції трахеї. При бронхоскопії вводять у бронхи 5 см³ 0,85 % розчину хлориду натрію, який потім відсмоктують в кількості 2-3 см³. При використанні вказаних методів проводять як якісне, так і кількісне визначення мікрофлори.

Взятий матеріал сіють на кров’яний, сироватковий, жовтково-сольовий та шоколадний агар, середовища Ендо й Сабуро.

Виявлення мікроорганізмів, які не є представниками нормальної мікрофлори, або збільшення кількості будь-якого виду аутофлори на фоні хвороби, свідчить про їх етіологічну роль при даному захворюванні

Мікрофлора кон’юктиви: коринебактерії, стафілококи, стрептококи, нейсерії, гемофільні бактерії.

Кількісний і якісний склад мікрофлори кон’юнктиви залежить від ступеня бактерицидності слізної рідини, в якій є фермент лізоцим і секреторний імуноглобулін А

Мікрофлора сечо-статевих органів: зовнішня частина уретри – пептококи, бактероїди, коринебактерії, кишкові палички, мікобактерії смегми.

У перші дві доби після народження піхва дівчаток стерильна. Іноді в ній є невелика кількість грампозитивних бактерій і коків. З 2—5 діб життя закріплюється кокова мікрофлора, яка зберігається до періоду статевого дозрівання, потім її заміняють молочнокислі бактерії (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum та ін.).

Під час менструального циклу вміст піхви стає лужним, що сприяє розвиткові кокової мікрофлори. У період статевого життя мікрофлора піхви змінюється, з’являється багато мікроорганізмів, внесених іззовні. Значних змін зазнає характер мікрофлори піхви при гіне­кологічних захворюваннях і після абортів.

Вміст піхви здорової жінки має відносно високу концентрацію глюкози і глікогену, низький вміст амілази і білків та рН 4,7, при якому всі види бактерій, крім молочнокислих, не можуть розви­ватися.

Кисле середовище піхви залежить від функції яєчників, достатньої кількості глікогену, який під впливом молочнокислих бактерій піхви перетворюється в моно- і дісахариди, а потім у молочну кислоту. Залежно від вмісту лейкоцитів і бактерій розрізняють чотири ступені чистоти піхвового вмісту; І і II ступені чистоти бувають у здорових жінок і характеризуються кислою реакцією (рН 4,в—5,5), наявністю молочнокислих бактерій і невеликої кількості лейкоцитів та грампозитивних диплококів; III і IV ступені чистоти бувають у жінок з запальним процесом у піхві, при цьому спостерігається збільшення кількості лейкоцитів і різноманітної мікрофлори, зменшення або цілковита відсутність молочнокислих бактерій, слабкокисла або слабколужна реакція  вмісту.

Бактерії піхви мають антагоністичні властивості, що відіграє захисну роль, однак ці властивості можуть порушуватись при шкідливій дії лікарських засобів (антибіотики, сульфаніламідні препарати, етакридину лактат, осарсол, калію перманганат та ін.), де яких молочнокислі бактерії більш чутливі, ніж інша мікрофлора.

 

Таблиця. Ступені чистоти вагінального секрету (Рис.)

 

 

Рис. І ступінь чистоти        Рис. ІІ ступінь чистоти

вагінального вмісту.               вагінального вмісту

 

 

Рис. ІІІ ступінь чистоти           Рис. ІV ступінь чистоти

вагінальнгого вмісту.                      вагінальнгого вмісту.

 

 

Мікрофлора сечових шляхів. У чоловіків у передній частині сечовипускного каналу знаходяться стафілококи, непатогенні коринебактерії, грамнегативні непатогенні бактерії. На зовнішніх статевих органах, а також у сечі у чоловіків і жінок трапляються Mycobaeterium smegmatis, мікоплазми.

Сечовипускний канал жінок звичайно стерильний; інколи у ньому може бути невелика кількість непатогенних коків

 

Значення нормальної мікрофлори людини

1.           Колонізаційна резистентність

2.           Антагоністична роль

3.           Імуностимулююча

4.           Участь у всіх видах обміну речовин

5.           Синтез вітамінів, гормонів, ферментів

6.           Травна роль

 

Методи вивчення мікрофлори людини.

Мікрофлору різних біотопів досліджують при діагностиці ендогенних інфекцій, бактеріоносійства, дисбактеріозів, у космонавтів, членів екіпажу підводних човнів та полярних експедицій для уникнення бактерійної несумісності. Бактеріоскопію і посіви найчастіше роблять із слизових оболонок рото- і носоглотки, зубного нальоту, секрету піхви, змивів із рук і шкіри, сечі та випорожнень.

Секрет слизових оболонок, взятий стерильним ватним тампоном, сіють ним же на кров’яний або цукровий агар в чашках Петрі штрихами на невеликій ділянці середовища, а потім розсівають по поверхні петлею для отримання ізольованих колоній. Чашки інкубують при 37 °С, виділяють та ідентифікують чисті культури.

Із зубного нальоту, карієсних зубів маленькими тампонами роблять мазки, забарвлюють за Грамом і досліджують мікроскопічно. Проводять також посіви на спеціальні середовища.

Для визначення ступенів чистоти вагінального секрету його беруть стерильними ватними тампонами, виготовляють мазки, забарвлюють і розглядають під мікроскопом (Рис. 4-7).

Посіви змивів із рук і шкіри проводять стерильним ватним тампоном, змоченим 0,85 % розчином хлориду натрію, у глюкозо-пептонне середовище за допомогою стерильного пінцета. Спочатку тампоном протирають шкіру долоні, тильного боку кисті, між пальцями, нігтьове ложе й під нігтями. Тампон опускають у назване середовище для виявлення кишечних бактерій. Звідси петлею роблять висів на МПА для виділення коків, грибів та інших мікроорганізмів. Далі виділяють чисті культури й визначають види, як і при дослідженні води.

Сечу центрифугують, із осаду виготовляють мазки і роблять посіви на живильні середовища.

 

Значення мікрофлори людини.

1.     Колонізаційна резистентність

2.     Антагоністична роль

3.     Імуностимулююча

4.     Участь у всіх видах обміну речовин

5.     Синтез вітамінів, гормонів, ферментів

6.     Травна роль

 

Дисбактеріози і способи їх попередження.

Дисбактеріоз – кількісні та якісні порушення екологічного балансу між мікробними популяціями в складі мікрофлори.

Його причини різні – нераціональне тривале вживання антибіотиків, пригнічення імунітету, вплив радіації, хронічні захворювання, перебування людей в екстремальних умовах тощо. Карієс зубів вже давно пояснюють дефектом нормальної ротової мікрофлори. Дисбактеріози майже завжди супроводжуються значним наростанням кількості антибіотикорезистентних бактерій, із якими боротися дуже важко.

 

Рис. Кандидоз ротової порожнини.

 

Необхідність досліджувати дисбактеріоз кишечника виникає при довготривалих проносах, при яких не виділяють патогенних ентеробактерій, після перенесення кишечних інфекцій із довгим періодом реконвалесценції, тривалої антибіотикотерапії, злоякісних пухлинах, перед операціями на органах черевної порожнини, у недоношених новонароджених та при захворюваннях, що важко піддаються лікуванню (ентероколіти, виразкові коліти, холецистити тощо).

Матеріал із шлунка й тонкої кишки беруть за допомогою спеціальних зондів або капсул, які відкриваються у певному відділі кишечного тракту й закриваються після взяття проби. Останнім часом для цієї мети широко використовують гастрофіброскопи та гастродуоденоскопи, які дозволяють брати на аналіз не лише вміст шлунка чи кишечника, а й біоптати їх слизової оболонки для дослідження мукозних бактерій. Матеріал із сигмовидної та прямої кишок беруть тампоном, трубкою Цімана, колонофіброскопом чи ректороманоскопом.

При діагностиці дисбактеріозу кишечника досліджують кал. Його вносять у заздалегідь зважені флакончики в кількості 0,5-1,0 г без консерванта й доставляють до лабораторії не пізніше 2 год після забору. Визначену наважку випорожнень розводять спеціальним буферним розчином від 10^-1 до 10^-12.

Із розведень 10^-3 – 10⁶ по 0,1 см³ сіють на середовища ЖСА (для виявлення стафілококів), кров’яний агар (для ентерококів і виявлення гемолітичних форм), Сабуро (для грибів), Вільсона-Блера (для клостридій).

Із розведень 10^-5 – 10^-8 по 0,1 см³ сіють на середовище Ендо (для ентеробактерій), МРС-2 і МРС-4 (для лактобактерій), а з розведень 10^-7– 10^-10 по 1,0 см³ засівають на середовище Блаурока, яке розливають високим стовпчиком (для біфідобактерій), та спеціальні середовища для бактероїдів.

Для виявлення патогенних ентеробактерій нативний рідкий кал, або з розведень 10^-1, бактеріологічною петлею сіють на середовища Ендо, Плоскірєва та вісмут-сульфіт агар. По 1-2 см³ із розведення 10^-1 сіють на середовища збагачення (Мюллера, селенітовий чи магнієвий бульйон). Склад і методика виготовлення всіх живильних середовищ приводиться в інструкції для діагностики дисбактеріозів.

Посіви для вирощування факультативно-анаеробних бактерій інкубують при 37 °С протягом 24-48 год, біфідобактерій – 48 год, анаеробів – 4-5 діб в анаеростатах, грибів – 96 год при 28-30 °С.

Після ідентифікації виділених культур проводять розрахунки кількості мікроорганізмів тієї чи іншої групи на 1 г випорожнень. Діагностику дисбактеріозу проводять за відхиленням показників кількісного вмісту бактерій різних таксономічних груп від нормальних величин.

Для проведення і лікування дисбактеріозів, крім раціональних методів хіміотерапії, використовують спеціальні бактерійні препарати (біфідобактерин, колібактерин, біфікол, бактисубтил тощо).

 

Про існування гнотобіотів — тварин (птахів), організм яких вільний від мікрофлори або є носієм тільки певних видів мікроорганізмів, було відомо ще в минулому столітті. Гнотобіоти поділяються на кілька груп: монобіоти (цілком вільні від мікрофлори), дибіоти (заражені одним видом мікроорганізмів) і полібіоти (що мають у своєму організмі кілька видів мікроорганізмів).

 

Тепер  розвивається  нова  галузь біології — гнотобіологія, яка вивчає життя макроорганізмів, вільних від мікрофлори. У спеціальних камерах вигодовуванням стерильною їжею вирощеногнотобіотних курчат, пацюків, морських свинок та інших тварин.

Гнотобіоти привернули увагу вчених у зв’язку з потребою глибшого вивчення ролі нормальної мікрофлори в механізмах інфекційної патології та імунітету. У гнотобіотів порівняно із звичайними тваринами збільшена сліпа кишка, недорозвинена лімфоїдна тканина, у них менша маса внутрішніх органів, об’єм крові, менше води у тканинах й антитіл у сироватці крові.

Гнотобіологія дає змогу точніше з’ясувати роль нормальної мікрофлори в процесах синтезу вітамінів, амінокислот, прояві природженого й набутого імунітету, пригнічення інших видів мікроорганізмів, внесених іззовні, в тому числі патогенних та умовно-патогенних, визначити характер взаємодії бактерій і вірусів. Великого значення надається гнотобіології при вивченні умов життя людини і тварин у космосі.

 

Санітарно-мікробіологічне дослідження змивів з об’єктів навколишнього середовища, медикаментозної сировини та готових лікарських засобів

 

Об’єкти бактеріологічного контролю:

1. Вода дистильована, ін’єкційні розчини для стерилізації, ін’єкційні розчини після стерилізації, очні краплі після стерилізації, сухі лікарські речовини, що використовуються для виготовлення ін’єкційних розчинів.

2. Аптечний посуд, корки, прокладки, інший допоміжний матеріал.

3. Інвентар, устаткування, руки, санітарний одяг персоналу.

4. Повітря середовища.

 

Методика бактеріологічного дослідження інвентаря,

устаткування, санітарного одягу, рук персоналу.

Змиви з інвентаря, устаткування проводять з допомогою ватних тампонів, які розміщені в пробірках з 2 мл фізіологічного розчину натрію хлориду або 0,85% пептонної води. Після ретельного протирання 100 см² поверхні інвентаря (площа обмежена трафаретом), всієї поверхні ваг тампон поміщають в ту ж пробірку і  додають 8 мл стерильного фізіологічного розчину натрію хлориду. Із вихідного змиву в залежності від ступеню забруднення готують ряд десятикратних розведень. 1 мл кожного розведення вносять у чашки  Петрі, в які виливають розтоплений МПА.

Для одержання змивів з лабораторного посуду в досліджуваний флакон або склянку наливають по 10 мл стерильного фізіологічного розчину натрію хлориду, ретельно струшуючи, сполощують всю внутрішню поверхню посуду. 1 мл цієї рідини засівають у розтоплений МПА,  а кількість колоній, яка виросте множимо на 10, що буде відповідати числу бактерій на всій поверхні посуду.  

Дослідження змивів із рук та предметів (столи, іграшки, м’який інвентар, предмети кухонного вжитку та ін.) роблять за певними епідеміологічними показаннями. У повсякденній роботі рідко проводять аналізи на безпосереднє виявлення патогенних мікроорганізмів, оскільки вони мають ряд труднощів. Значно частіше виявляють санітарно-показові бактерії: БГКП, стафілококи, ентерококи.

Змив проводять стерильним тампоном, вміщеним у пробірку з МПБ або глюкозо-пептонним середовищем. Сухий тампон проштовхують до повного змочування у бульйоні, виймають і роблять змив. Спочатку протирають шкіру лівої, потім правої руки в такій послідовності: тил кисті, долоня, міжпальцеві проміжки, нігтьові ложа. Після закінчення змиву тампон знову занурюють у середовище. Пробка при цьому становиться на своє місце й закриває пробірку.

При проведенні змивів із предметів, що мають велику поверхню (столи, стіни, дошки для обробки м’яса та інших продуктів), досліджувану ділянку обмежують спеціальною рамкою-трафаретом, що має площу 25, 50 або 100 см². Цей шаблон виготовляють із дроту, перед вживанням і після змиву його обпалюють на вогні. Для визначення загального мікробного обсіменіння із пробірки після ретельного віджимання тампону й перемішування 1 см³ рідини вносять у стерильну чашку Петрі, заливають 15 мл розтопленого й охолодженого агару. Посіви інкубують 24 год при 37°С, підраховують число колоній, визначають ЗМЧ. Для порівняльної оцінки отриманих результатів бажано вести розрахунки на 1 см² поверхні.

Визначення БГКП, стафілококів та ентерококів (індикаторні мікроорганізми) проводять шляхом посіву на елективні середовища. Колонії підраховують та ідентифікують так само, як і при аналізі води.

 

 

Проби повітря відбирають в наступних приміщеннях:

1.           – в асептичному блоці, стерилізаційній;

2.           – в асистенській, фасувальнй, кімнаті дефектара і матеріальній;

3.           – у мийній;

4.           – у залі обслуговування.

 

Таблиця. Санітарні нормативи мікрофлори повітря аптечного закладу

 

 

 

Вплив навколишнього середовища на мікроорганізми

Дія фізичних факторів.

Температура. Низькі температури бактерії витримують порівняно легко. Культури мікроорганізмів у замороженому вигляді зберіга­ються в лабораторних умовах більш як 80 років. Виділено життє­здатний мікроорганізм із товщі льодовиків,   вік яких 12 000 років.

Холерний вібріон не гине при температурі —32 °С; деякі види бактерій зберігають життєздатність при температурі рідкого повітря (—190 °С), рідкого водню (—253 °С). Коринебактерії дифтерії переносять заморожування протягом 3 місяців. Сальмонели черевного тифу довго живуть у кризі. Спори бацил витримують температуру —250 °С протягом 3 діб. Багато вірусів стійкі до низьких температур. Так, наприклад, вірус японського енцефаліту в 10 % зависі мозку не знижує своєї патогенності при — 70° С протягом року, збудники грипу при —70 °С — протягом 6 місяців, вірус Коксакі при —40 °С — більш як 1,5 року.

Низькі температури припиняють процеси гниття і бродіння. На цьому принципі грунтується використання в практиці льодовень, льохів і холодильних установок для зберігання харчових продуктів.

Окремі патогенні види мікроорганізмів (менінгокок, гонокок та ін.) дуже чутливі до низьких температур. При нетривалій дії охолодження термолабільні мікроорганізми досить швидко гинуть. Цю обставину враховують у лабораторній діагностиці: матеріали, що досліджуються на менінгіт або гонорею, доставляють у лабораторію захищеними від охолодження. При низьких температурах сповільнюються процеси обміну речовин, бактерії відмирають внаслідок старіння і голодування, клітини їх руйнуються під впливом підвищення токсичності іонів.

Згубно діють на бактерії високі температури. Більшість аспорогенних бактерій гине при температурі 58—60 °С через ЗО—60 хв, при 100 °С — протягом  2—3  хв.

Силікатні бактерії зберігаються життєздатними після діяння на них нагрівання до  160 °С.

Спори бацил і клостридій більш стійкі, ніж вегетативні форми. Вони витримують кип’ятіння від кількох хвилин до 3 год, але гинуть від діяння сухого жару при температурі 160—170 °С протягом 60—90 хв; нагрівання при 120 °С під тиском пари 2026,5 кПа (2 атм) вбиває їх за 20—ЗО хв.

Індивідуальні і видові коливання стійкості бактерій до високих температур мають досить широкий діапазон.

В основі бактерицидної дії високих температур лежать ушкодження рибосом, руйнування третинної структури білків і цитоплазматичних мембран, порушення осмотичного бар’єру. Високі температури досить швидко зумовлюють руйнування багатьох вірусів.

Віруси гепатиту А, поліомієліту та інші довго зберігаються у воді, у випорожненнях хворих або носіїв, стійкі до нагрівання при температурі 60 °С і діяння малих концентрацій хлору у воді.

Висушування. Стійкість мікроорганізмів до висушування різна. Чутливі до висушування гонококи, менінгококи, трепонеми, лептоспіри, гемофільні бактерії, фаги. Холерний вібріон не гине під впливом висушування 2 доби, шигели — 7, чумна паличка — 8, дифтерійна — ЗО, черевнотифозна — 70, стафілококи і мікобактерії туберкульозу — 90 діб. Висохле мокротиння хворих на туберкульоз залишається заразним 10 місяців, спори бацил сибірки зберігаються до 10 років, плісеневих грибів — 20 років.

Висушування супроводиться обезводненням цитоплазми і денатурацією  білків  бактерій.

Одним із методів консервування харчових продуктів є  сублімація — обезводнення при низькій температурі і високому ваку­умі, яке супроводиться випаровуванням води, швидким охолоджен­ням і заморожуванням. Крига, що утворилася в продукті, легко суб­лімується, минаючи рідку фазу. Тривалість збереження харчових продуктів понад 2 роки. Сублімаційне сушіння забезпечує збережен­ня всіх цукрів, вітамінів, ферментів та інших компонентів.

Висушування у вакуумі при низькій температурі не вбиває бактерії і віруси. Цей метод збереження культур використовують у виробництві стабільних і з тривалим строком зберігання живих вакцин проти туберкульозу, чуми, туляремії та інших захво­рювань.

Промениста енергія. Різні види випромінювання мають бактерицидну або стерилізуючу дію. До них належать ультрафіолетове, рентгенівське, альфа-, бета-, гамма- і нейтронне. Найбільш виражену бактерицидну дію має пряме сонячне проміння. Ультрафіолетове опромінювання спричиняє утворення перекисів, що діють на мікроорганізми як окислювачі, пошкоджує молекули ДНК в результаті  появи  піримідинових димерів.

Досвід використання короткохвильового випромінювання для дезинфекції палат, знезаражування інфікованого матеріалу, консер­вування харчових продуктів, приготування вакцин, обробки приміщень операційних, пологових палат і т. д. показав, що воно має дуже високу бактерицидну дію. Під впливом ультрафіолетового випромінювання з довжиною хвилі 260—300 мкм відбувається швидка інактивація вірусів. При цьому ультрафіолетове випромінювання поглинається  нуклеїновою кислотою вірусів.

Віруси порівняно з бактеріями менш стійкі проти дії рентгенівського та альфа-випромінювання; бета-випромінювання має більш виражену віруліцидність. У невеликих дозах альфа-, бета-, гамма-випромінювання сприяє життєдіяльності вірусів, а в великих — має згубну дію. Віруси, патогенні для тварин, інактивуються від дії випромінювання 11 352—72 240 мКл/кг (44 000—280 000 Р). Високу стійкість проти іонізуючого випромінювання мають тіонові бактерії, які живуть у покладах уранових руд. Деякі види бактерій виявляли у воді атомних реакторів при дозі іонізуючого випромінювання 20 000—30 000  грей  (Дж/кг).

Іонізуюче випромінювання може бути використане у практиці стерилізації харчових продуктів. Цей метод холодної стерилізації має низку переваг: він не змінює якості продукту на відміну від теплової стерилізації, при якій настає денатурація його складових частин (білки, полісахариди, вітаміни). Променеву стерилізацію можна застосовувати для обробки біологічних препаратів (вакцин, сироваток, фагів та  ін.).

Становить інтерес феномен фотореактивації, який поля­гає в тому, що бактерії, попередньо опромінені видимим світлом, стають більш стійкими проти дії ультрафіолетового проміння. Якщо ж після обробки ультрафіолетовим промінням завись Е. соlі опромінити видимим світлом, настає значний ріст бактерій при висіванні на живильні середовища (механізм цього феномена розглядається.

Високий тиск, ультразвук, механічний струс. Дію високого атмосферного тиску — 10 132,5 — 91 192,5 кПа (100—900 атм) на глибині морів і океанів 1000—10 000 м бактерії переносять легко. Дріжджі зберігають свою життєздатність при тискові 50 662,5 кПа (500 атм). Деякі бактерії, дріжджі, плісені витримують тиск 303 975 кПа (3000 атм),   фітопатогенні віруси — 506 625 кПа (5000 атм).

Ультразвук має бактерицидні властивості, що використовують для стерилізації харчових продуктів, виготовлення вакцин і дезин фекції предметів. Механізм бактерицидної дії ультразвуку полягає в тому, що в цитоплазмі бактерій, які містяться у водному середовищі, утворюється кавітаційна порожнина, що заповнюється парою рідини; у бульбашці виникає тиск до 1 013 250 кПа (10 000 атм), що призводить до руйнування цитоплазматичних структур бактеріальної клітини. Можливо, що в кавітаційних порожнинах, які при цьому утворюються, виникають влсокореактивні гідроксильні радикали.

Певне значення у знезаражуванні повітря надається а є р о і о н і-з а ц і ї. Негативно заряджені іони згубно діють на бактерії.

Ефективна й електрогідравлічна бактерицидна дія на мікроорганізми, що виникає під впливом фізичних і хімічних явищ в результаті високого тиску, кавітаційних процесів, ударних хвиль та іонізації, ультрафіолетового й ультразвукового випромінювання, імпульсного магнітного поля. Це може бути використано для знешкодження стічних вод, дегельмінтизації гною, стерилізації молока, різних соків, харчових продуктів, а також у виробництві інактивованих вакцин, антигенів, для обробки кормових і пивних дріжджів.

Дія хімічних речовин

Залежно від фізико-хімічного складу середовища, концентрації, тривалості контакту, температури хімічні речовини по-різному впливають на мікроорганізми. У малих дозах вони діють як подразники, а в бактерицидних концентраціях паралізують життєдіяльність бактерій.

За дією на бактерії бактерицидні хімічні речовини поділяють на поверхнево-активні, феноли та їх похідні, барвники, солі важких металів, окислювачі і групу формальдегіду.

Поверхнево-активні речовини, або детергенти, можуть нагромаджуватись на поверхні розділяння фаз і спричиняти різке зниження поверхневого натягу, що призводить до порушення нормального функціонування клітинної стінки і цитоплазматичної мембрани. До бактерицидних речовин з поверхнево-активною дією належать жирні кислоти, в тому числі і мила, які спричинюють ушкодження тільки клітинної стінки і не проникають у клітину. Широко використовуються синтетичні детергенти, які краще розчиняються у воді.

Фенол, крезол та їх похідні спершу ушкоджують клітинну стінку, а потім і білки клітини. Деякі речовини цієї групи пригнічують функцію коферменту (дифосфопіридиннуклеотиду), який бере участь у дегідруванні глюкози і молочної кислоти.

Барвники мають властивість затримувати ріст бактерій. В основі їх дії лежить виражена спорідненість із фосфорнокислими групами нуклеопротеїдів. До барвників з бактерицидними властивостями нале­жать брильянтовий зелений, риванол, трипафлавін, акрифлавін та ін.

Солі важких металів (свинець, мідь, цинк, срібло, ртуть) спри­чинюють коагуляцію білків клітини. При взаємодії солі важкого металу з білком утворюються альбумінат металу і вільна кислота (R—СООН + AgNO₃-> COOAg + HNO₃).

Деякі метали (срібло, золото, мідь, цинк, олово, свинець та ін.) мають олігодинамічну дію (бактерицидна властивість). Так, наприклад, посуд із срібла, посріблені предмети, посріблений пісок при контакті з водою надають їй бактерицидних властивостей щодо багатьох видів бактерій. Механізм олігодинамічної дії полягає в тому, що позитивно заряджені іони металів адсорбуються негативно зарядженою поверхнею бактерій і змінюють проникність їх цитоплазматичної мембрани. Можливо, що при цьому порушується живлення і розмноження бактерій. Віруси також дуже чутливі до солей важких металів, під впливом яких вони необоротно інактивуються.

Окислювачі діють на сульфгідрильні групи активних білків; сильніші окислювачі шкідливо впливають і на інші групи (фенольні, тіо-етилові, індольні й амінні). До окислювачів належать хлор, який діє на дегідразу, гідролазу, амілазу, протеазу бактерій, внаслідок чого його широко використовують для знезаражування води, а також, хлорне вапно і хлорамін, що застосовуються для дезинфекції. Як антибактеріальний засіб у медицині з успіхом застосовують йод у вигляді спиртового розчину, який не тільки окислює активні групи білків цитоплазми бактерій, а й спричинює їх денатурацію.

У зв’язку з можливою побічною дією йоду рекомендується застосовувати в хірургічній практиці хлоргексидин, який має високу антибактеріальну активність щодо як грампозитивних, так і грамнегативних мікроорганізмів. Його використовують для обробки рук персоналу, шкіри, операційного поля хворих, яких оперують, для дезинфекції інструментів, катетерів, апаратів інгаляційного наркозу. Хлоргексидин застосовують для лікування гнійних ран, промивання операційних ран і порожнин.

Окислювальні властивості, крім названих речовин, мають калію перманганат, перекис водню та ін.

Багато видів вірусів стійкі проти дії ефіру, хлороформу, етилового і метилового спирту, ефірних масел. Майже всі віруси довго зберігаються в розчинах гліцерину Рінгера, Тіроде. Віруси руйнуються під впливом NaOH, KOH, а також хлораміну, хлорного вапна, хлору, інших окислювачів.

Формальдегід застосовують у вигляді 37—40 % розчину, що ді­став назву формаліну. Його бактерицидна дія, як вважають, пояснюється тим, що він приєднується до аміногруп білків і спричинює їх денатурацію. Формальдегід убиває як вегетативні форми, так і спори мікроорганізмів. Його застосовують для знешкоджування дифтерійного, правцевого та інших екзотоксинів, в результаті чого вони перетворюються в анатоксини. Крім формальдегіду, алкілюючу дію має етиленоксид (газ), який застосовують для дезинфекції різних  поверхонь.

Вплив біологічних факторів

У природних умовах мікроорганізми є складовою частиною біоценозу (сукупності рослин і тварин, які населяють ділянку середовища існування з більш чи менш однорідними умовами життя).

Бактерії перебувають у природі в асоціаціях, між якими точиться невпинна боротьба за існування. Одні види, що пристосувались до відповідного середовища, мають більш виражені антагоністичні властивості щодо інших видів, які потрапляють у нове середовище існування. Так, наприклад, молочнокислі бактерії мають антагоністичні властивості щодо збудників дизентерії, чуми та ін. Синьогнійна бактерія пригнічує ріст шигел, сальмонел, бацил сибірки, холерного вібріона, збудників чуми, сапу, стафілококів, менінгококів та ін. Особливо сильні антагоністичні властивості мають мікроорганізми, які постійно живуть у людському організмі: Е. coli, S. faecalis, молочнокислі бактерії, актиноміцети, мікроорганізми шкіри, носової частини глотки та ін.

Тепер доведена можливість антагоністичних взаємин між патогенними штамами одного й того самого виду мікроорганізмів. Такі властивості мають деякі штами Е. coli, стрептококи пневмонії, сальмонели, шигели, стафілококи та ін., які продукують бактеріоцини.

У певних умовах існування мікроорганізмів антагонізм виникає в результаті нестачі поживних речовин, і тоді одні види змушені живитися за рахунок інших. Так, наприклад, паразитичні бактерії Bdellovibrio bacteriovorus мають властивість проникати у деякі гра-негативні і грампозитивні бактерії, розмножуватися в них і руйнува­ти їх. Бактерії-ендосимбіонти, які живуть на найпростіших, комахах, грибах, безхребетних і членистоногих, дуже поширені в природі (грунт, морська вода, випорожнення); вони відіграють важливу роль в елімінації з навколишнього середовища патогенних і умовно-пато­генних видів (сальмонели, Е. coli та ін.).

Антагоністичні взаємини виявлено й серед вірусів, коли один вірус захищає організм від проникнення в нього іншого вірусу. У вірусології це явище дістало назву інтерференції   вірусів.

Між різними групами мікроорганізмів є кілька типів взаємовідношень: симбіоз, метабіоз, сателізм, синергізм, антагонізм.

Симбіоз — це співжиття мікроорганізмів різних видів; разом вони розвиваються краще, ніж кожен із них зокрема. Іноді пристосованість організмів один до одного так поглиблюється, що вони втрачають здатність існувати нарізно (співжиття грибів і синьо-зелених водо­ростей, азотфіксуючих і целюлозоруйнівних бактерій, бульбочкових бактерій і бобових рослин, різних грибів і коренів рослин, дріждже­подібних грибів і лямблій). Найтиповіший симбіоз (симбіогенез) ви­явлено у лишайників.

Однією з форм симбіозу є вірогенія — співіснування деяких бактерій, дріжджів і найпростіших з вірусами.

Метабіоз — такий тип взаємовідношень, коли продукти життєдіяльності одного виду є джерелом живлення іншого виду (наприклад, нітрифікуючі й амоніфікуючі бактерії).

При сателізмі один із співчленів — він називається сприяючим мікроорганізмом — стимулює ріст другого співчлена (деякі дріжджі і сарцини, що продукують амінокислоти, вітаміни й інші речовини, сприяють росту більш вибагливих до поживних середовищ видів).

Синергізм характеризується посиленням фізіологічних функцій у членів асоціації (дріжджі і молочнокислі бактерії, фузобактерії і борелії).

При антагонізмі відбувається боротьба мікроорганізмів різних видів за кисень, Живильні речовини і місце існування. Бактерії, гриби, вищі рослини виробляють речовини, що дістали назви антибіотик і в, які згубно діють на інші мікроорганізми. їх широко застосовують у лікуванні багатьох інфекційних захворювань.

Важливу роль у знешкоджуванні зовнішнього середовища від патогенних мікроорганізмів внаслідок антагонізму відіграють ф а г и (віруси бактерій), дуже поширені у грунті і воді, і фітонциди — леткі речовини багатьох рослин.

 

Хіміопрепарати. Антибіотики

За характером взаємовідношень з рослинним і тваринним світом мікроорганізми поділяють на дві групи: сапрофіти і паразити. До сапрофітів відносять’мікроорганізми, що не мають властивості спри­чиняти захворювання. Групу паразитів становлять види, які присто­сувалися до життя за рахунок організмів рослин, тварин і людини.

Співжиття мікроорганізму з макроорганізмом, або симбіоз, трап­ляється  в  кількох формах.

Коменсалізм — симбіоз організмів, при якому один із них живе за рахунок іншого, не завдаючи йому шкоди. До мікроорганізмів-коменсалів належить переважна більшість представників нормальної мікрофлори   організму  людини.

Мутуалізм — така форма симбіозу, при якій обидва зв’язаних один з одним організми мають із свого співжиття взаємну вигоду. Наприклад, симбіоз бульбочкових бактерій з бобовими рослинами характеризується типовим мутуалізмом. Бульбочкові бактерії жи­вуть у коренях рослин, а бобові рослини, в свою чергу, використову­ють для живлення азотисті сполуки, що виробляються бактеріями з  атмосферного  азоту.

Типовим прикладом мутуалізму можуть бути численні лишайники (арктичний оленячий мох та ін.), що складаються з зеленої або синьо-зеленої водорості і гриба — аскоміцету або базидіоміцету. Водорості синтезують поживні речовини (фотосинтез), а гриби виконують захис­ну функцію і забезпечують водорості водою та мінеральними солями.

Деякі види бактерій із групи кишкової мікрофлори перебувають у симбіозі з організмами тварин, у яких вони існують. Ці мікроорга­нізми -мутуалісти живляться рештками їжі, що надходять у нижні відділи кишечника, а продуковані ними вітаміни використовуються тваринами для біокаталітичних реакцій.

Паразитизм — симбіоз, при якому один організм (паразит) живе за рахунок іншого (хазяїна) і завдає йому шкоди. Деякі мікроорганіз-ми-паразити спричиняють інфекційні захворювання рослин і тварин.

Хвороботворні види мікроорганізмів називаються патоген­ними. В процесі свого еволюційного розвитку вони пристосувались до паразитичного типу живлення у тканинах і рідинах тваринного організму. Сприйнятливий інфікований організм відповідає на про­никнення патогенного мікроорганізму неспецифічними і специфіч­ними біологічними реакціями, які виражаються в атипових або ти-по-вих проявах захворювання, а також у найрізноманітніших захисних пристосуваннях.

У свій час Я. Генле (1878), а потім Р. Кох (1882) сформулювали три умови, за яких мікроорганізм може бути визнаний збудником захворювання: 1) мікроорганізм-збудник має виявлятися в усіх ви­падках при цьому захворюванні і не траплятися ні в здорових, нї у хворих на інші захворювання; 2) мікроорганізм-збудник повинен бути виділений з організму хворого в чистій культурі; 3) чиста куль­тура виділеного мікроорганізму повинна спричиняти те саме захво­рювання у сприйнятливих тварин. Тепер ця тріада значною мірою втратила своє значення.

Для виникнення і розвитку інфекційного процесу потрібні три ланки: 1) наявність патогенного мікроорганізму; 2) проникнення його у сприйнятливий макроорганізм; 3) певні умови середовища, в якому відбувається  взаємодія  мікро-  та  макроорганізму.

Взаємовідношення збудника із сприйнятливим макроорганізмом відбуваються у складних умовах паразитоценозу, тобто в різних спів­відношеннях з іншими бактеріями, вірусами, грибами і найпрості­шими. Наслідки проникнення в організм людини патогенних видів залежать не тільки від реактивності макроорганізму, а й від нормаль­ної мікрофлори тіла людини, яка може проявляти себе як антагоні­стично, так і синергетично.

Поряд із патогенними є порівняно велика група мікроорганізмів, що дістали назву умовно-патогенних; вони живуть на шкірі, в кишках, дихальних шляхах, сечостатевих органах. За нор­мальних фізіологічних умов життя умовно-патогенні бактерії не спричиняють захворювань, але при перевтомі організму, перегрі­ванні, охолодженні, інтоксикації, діянні іонізуючого випромінювання, зниженні природної резистентності вони стають здатними спричиняти низку   аутоінфекцій.

В основі відкриття антимікробної дії лежить явище бактеріального антагонізму. Воно характеризується тим, що один вид мікроорганізмів (бактерії, актиноміцети, гриби, водоростей) здатний пригнічувати або  затримувати ріст інших.

Яскравою формою антагонізму, широко розповсюдженою у світі мікробів, є утворення специфічних продуктів обміну, що пригнічують розвиток організмів інших видів. Такі речовини одержали назву  антибіотиків  (грец. anti – проти, bios – життя).  Ввів цей термін у 1942 р. З. Ваксман. За його визначенням це хімічні речовини, що утворюються мікробами, і здатні пригнічувати ріст або руйнувати бактерії та інші мікророганізми.

 

Антибіотики – це хіміотерапевтичні засоби, що утворюються мікроорганізмами

або отримані з інших.

природних джерел, а також їх похідні та синтетичні продукти, що мають здатність

вибірково пригнічувати в організмі хворого збудників захворювань.

Антибіотики мають характерні особливості, що відрізняють їх від інших продуктів життєдіяльності.

1.Висока біологічна активність. Антибіотичні речовини спричинюють біологічний ефект у дуже низьких концентраціях.  (Пеніцилін у концентрації 0,000001 г/мл має виражену бактерицидну дію на бактерії).

2.Виражена вибіркова специфічність. Кожний антибіотик проявляє активність тільки  по відношенню до певних груп організмів, не завдаючи шкоди іншим. Так, бензилпеніцилін затримує ріст грампозитивних  бактерій (стафілококів, стрептококів) і практично не діє на грамнегативні мікроби, гриби.

Біологічну активність антибіотиків оцінюють в умовних одиницях, які містяться в 1 мл розчину (од/мл) або 1 мг препарату (од/мг). За одиницю антибіотичної активності приймають мінімальну кількість препарату, здатну затримати ріст певного числа клітин стандартного штаму тест-мікробів в одиниці об’єму живильного середовища.

Одиницею активності пеніциліну є мінімальна кількість препарату, здатна затримувати ріст  штама Staphylococcus aureus 209 у 50 мл живильного бульйону.

Одиниця активності  стрептоміцину – мінімальна кількість речовини, яка затримує ріст E. coli  в 1 мл живильного бульйону.

Колонії Streptomycetes, що продукують стрептоміцин

Хіміотерапевтичний індекс – відношення максимальної дози препарату, що переноситься хворим (Dosis tolerantia), до мінімальної лікувальної (Dosis curativa). Цей показник не повинен бути меншим 3.

Хіміотерапевтичні препарати: галогенові (хлорамін, хлорцин, пантоцид), (йодоформ, йодикол, розчин Люголя); окисники (перекис водню, перстерил, дезоксон-1); солі важких металів (ртуті, срібла, міді, цинку, свинцю, вісмуту); нітрофурани (фурацилін, фурадонін, фуразолідон, фурапласт); барвники (похідні хіноліну, хіноксаліну); альдегіди (формальдегід, лізоформ, цитраль); кислоти (бензойна, саліцилова, борна, бікармінт, цигерол); поверхнево-активні речовини; сульфаніламідні препарати (сульфадимезин, фталазол, сульгін, сульфадиметоксин, бісептол).

 

Бактеріостатична дія препарату– препарат затримує ріст і розмноження бактерій.

Бактерицидна дія препарату – препарат зумовлює загибель мікроорганізмів.

 

Класифікації антибіотиків

 

 

 

 

 

Механізм дії антибіотиків

 

 

 

 

Напівсинтетичні пеніциліни

 

 

Варіанти цефалоспоринів

 

 

До препаратів, що використовуються в лікарській практиці, ставляться певні вимоги:

– висока вибірковість антимікробного ефекту в дозах, нетоксичних для організму;

– відсутність або повільний розвиток резистентності збудників до препарату під час його застосування;

– збереження антимікробного ефекту в рідинах організму, ексудатах, тканинах, відсутність або низький рівень зв’язування білками сироватки крові, інактивації тканинними ферментами;

– всмоктуванння, розподіл препарату, що забезпечує терапевтичні концентрації в крові, тканинах, рідинах, які швидко досягаються і підтримуються протягом  тривалого періоду; створення високих концентрацій препарату в сечі,  жовчі, калі, вогнищах ураження;

– зручна лікарська форма, яка забезпечує  максимальний ефект, і залишається стабільною  при звичайних умовах зберігання.

 

РЕЗИСТЕНТНІСТЬ МІКРОРГАНІЗМІВ ДО АНТИБІОТИКІВ

 

Під резистентністю мікроорганізмів до антибактеріальних засобів розуміють збереження їх здатності до розмноження в присутності  таких концентрацій цих речовин, які створюються  при введенні терапевтичних доз.

 

Типи стійкості бактерій до антибіотиків

      Перший тип – природна стійкість, яка визначається  властивостями даного виду або роду мікроорганізмів.      (Стійкість   грамнегативних   бактерій до  бензилпеніциліну, бактерій – до протигрибкових, грибів – до антибактеріаль- них препаратів).

     Другий тип – набута стійкість.

Вона може бути первинною і вторинною.

Термін “набута стійкість” застосовують у випадках, коли в чутливій до  даного  препарату  популяції  мікроорганізмів  знаходять резистентні варіанти.  Вона виникає, в основному, внаслідок мутацій, що відбуваються в геномі клітини.

Первинна стійкість (як результат мутації) виявляється  в окремих клітинах популяції через її гетерогенність до початку лікування антибіотиками.

Вторинна стійкість формується також за рахунок мутацій може зростати  при контакті бактерій з антибіотиками. Мутації ненаправлені та не пов’язані  із дією антибіотиків. Останні відіграють лише роль селекціонуючих агентів.  Вони елімінують чутливі особини популяції і, відповідно, починають переважати резистентні клітини.

Залежно від швидкості виникнення мутантів набута вторинна стійкість  буває двох типів:        стрептоміциного     й      пеніцилінового.

Стрептоміциновий тип виникає як “одноступенева мутація“, коли швидко відбувається утворення мутантів з високою стійкістю після одно-двократного  контакту мікроба з антибіотиком. Ступінь її не залежить від концентрації препарату (стрептоміцину, рифампіцину, новобіоцину). 

Пеніциліновий тип резистентності формується  поступово, шляхом “багатоступеневих мутацій”. Селекція стійких варіантів при цьому відбувається повільно (пеніцилін, ванкоміцин, левоміцетин, поліміксин, циклосерин)

 

Резистентність мікробів до антибіотиків забезпечується генами, які локалізуються або у хромосомі, або у складі позахромосомних елементів спадковості (транспозони, плазміди).

Хромосомні мутації – найчастіша причина зміни рецептора, мішені, з якою взаємодіють ліки. Так, білок Р10 на 30s субодиниці бактеріальної рибосоми є рецептором для прикріплення стрептоміцину. У бактерій, стійких до дії еритроміцину, може пошкоджуватись сайт на 50s субодиниці рибосоми внаслідок метилювання 23s рРНК.

 

R-плазміди можуть містити від одного до десяти і більше різних генів лікарської резистентності, що робить мікроб нечутливим до переважної більшості антиібіотиків, які використовуються в клініці. Деякі з них (кон’югативні, трансмісивні) здатні передаватись від одного бактеріального штаму до іншого не тільки в межах одного виду, але й часто різних видів і навіть родів мікробів. Крім кон’югації можлива передача детермінант стійкості  за допомогою трансдукції (у стафілококів), а також трансформації.

 

 

Плазміди резистентності

 

     

У деяких мікроорганізмів описано ще один клас мігруючих генетичних елементів – транспозони. Часто такі елементи виявляються у стафілококів, ентеробактерій (транспозон Tn551 несе маркери резистентності до еритроміцину, Tn552 – до пеніциліну, Tn554 – до еритроміцину і спектино-міцину).  Небезпека їх полягає в тому, що вони можуть інтегруватись як з кон’югативними R-плазмідами, так і з трансдукуючими r-факторами.

 

Плазміди кодують синтез ферментів, які руйнують антибіотики. Наприклад, стафілококи, які резистентні до пеніциліну, цефалоспоринів, продукують

b-лактамазу.

Грамнегативні бактерії (штами Proteus, Klebsiella, Escherichia) також здатні синтезувати цей фермент, який розщеплює ампіцилін, деякі цефалоспорини (цефалотин, цефалоридин, цефазолін та ін.).

 

Резистентні до левоміцетину бактерії синтезують хлорамфенікол-ацетилтрансферазу, штами, стійкі до аміноглікозидів, – ферменти аденілування, фосфорилювання, ацетилювання, які направлено проти відповідних антибіотиків.

 

Виникнення резистентних форм

 

Попередити формування антибіотикостійких  популяцій можна за рахунок  використання комбінацій двох антимікробних сполук або антибіотиків з препаратами, які підвищують адсорбцію і проникнення їх у мікробну клітину, здатних інтенсифікувати їх поділ, поліпшувати доступ  препарату до бактерій.

При наявності стійких форм бактерій в організмі можна  застосувати препарати з іншим механізмом дії; елімінацію плазмід сполуками, які діють на ДНК мікробів та їх мембрани,  використанням антибіотиків зі сполуками, що блокують ферменти, які руйнують препарати (пеніциліни, цефалоспорини, аміноглікози- ди, хлорамфенікол), підвищують адсорбцію та проникнення  антимікробних препаратів у клітину і підвищують природну чутливість  останніх.

Комбінована дія антибіотиків

Ефект тетрацикліну на деколоризацію зубної емалі                        Побічний ефект після прийому ріфампіну

Результат лікування ангіни антибіотиками

 

Визначення чутливості бактерій
до антибіотиків

 

Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків та вивчення їх фармакокінетики в організмі хворого є основними лабораторними показниками, які при їх співставленні дозволяють прогнозувати ефективність антибактеріальної терапії. Крім того, результати визначення антибіотикочутливості використовують як маркер, що дозволяє виявляти та контролювати зміни антибіотикограми збудників у динаміці, використовувати детермінанти резистентності, які найчастіше зустрічаються, або їх сполучення як додаткові маркери при діагностиці внутрішньолікарняних інфек­цій, для виявлення джерел інфікування та шляхів розповсюдження полірезистент­них штамів. Такі дані, одержані та узагальнені у різних регіонах країни протягом фіксованих проміжків часу, використовуються при формуванні політики антибак­тері­альної терапії та визначенні номенклатури антибіотиків, які випускаються в країні.

Найрозповсюдженішими методами визначення антибіотикочутливості збуд­ни­ків інфекцій є диско-дифузійний (метод дисків) та серійних ­розведень.

Живильні середовища для визначення чутливості бактерій до антибіотиків повинні відповідати таким вимогам:

• бути стандартними та забезпечувати оптимальні умови росту мікроорганізмів;

• не містити інгібіторів бактеріального росту і великої кількості стимуляторів;

• не мати речовин, що пригнічують активність препаратів.

На результати дослідження може суттєво впливати значення рН середовища. Найдоцільніше вибирати нейтральне або дещо лужне середовище (рН 7,0-7,4), оскільки ці значення придатні для більшості антибіотиків. При визначенні чутливості бактерій використовують бульйон і 1,5-2 % агар на переварі Хоттінгера, звичайний м’ясо-пептонний бульйон і 1,5-2 % агар на ньому, середовище АГВ (агар Гівенталя-Вєдьміної), агар Mueller-Hinton 2. Вони придатні при визначенні антибіотикочутливості стафілококів, ентеробактерій, псевдомонад. Однак стрептококи та гемофільні бактерії вимагають добавки ростових факторів; дріжджі та анаеробні бактерії – спеціальних середовищ і певних умов культивування. На результати визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків-аміноглікозидів, поліміксинів, тетрациклінів впливає вміст у живильних середовищах катіонів кальцію, магнію, що особливо важливо при дослідженні P. aeruginosa. Оптимальний вміст – 50 мг/л Са2+ і 25 мг/л Mg2+. Більшість середовищ, що випускаються країнами СНД, за цим показником, як правило, не стандартизуються. Це призводить до суттєвих коливань вмісту двовалентних катіонів у різних серіях середовищ, навіть якщо вони випускаються одним підприємством, і спотворює результати.

 

Диско-дифузійний метод визначення антибіотикочутливості є найпростішим якісним методом і широко використовується для епідеміологічного контролю резистентності. Достовірність результатів забезпечується шляхом стандартизації проведення тесту на всіх етапах дослідження: вибір і виготовлення живильних середовищ із врахуванням всіх властивостей можливих збудників, взяття проб і умови їх доставки, виготовлення і розливання посівного матеріалу на поверхню агару, вибір дисків (використання набору дисків у відповідності до виду виділеного збудника та локалізації інфекції).

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків слід визначати тільки у чистій культурі. Однак у ряді випадків для швидкого одержання орієнтовних даних про антибіотикограму бактерій використовують безпосередньо патологічний матеріал. Щільні субстрати (харкотиння, гній, кал та ін.) розтирають, рідини (сеча, ексудати та ін.) центрифугують, а для посіву використовують осад. Досліджуваний матеріал наносять на поверхню живильного середовища петлею або ватним тампоном. Після одержання чистої культури дослідження повторюють.

Для виготовлення інокулюму 5-10 однорідних колоній суспендують у 2 мл рідкого середовища або фізіологічного розчину. Бактеріальну суспензію (103-105 КУО/мл залежно від виду мікробів) в об’ємі 1 мл рівномірно розподіляють по поверхні середовища при похитуванні чашки, надлишок рідини видаляють піпеткою. Чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, а потім на них на однаковій віддалі кладуть диски з антибіотиками.

Рівномірність газону, яка визначається величиною посівної дози, – найголовніший фактор одержання достовірних результатів і підлягає кількісній оцінці та якісній стандартизації. Ступінь нестандартності результатів дослідження, який пов’язаний із зміною величини дози інокулюму, варіює залежно від виду збудників, властивостей антибіотика та інших факторів. При невеликій дозі інокулюму при визначенні чутливості до бета-лактамних препаратів пеніциліназо-утворюючих бактерій можна одержати великі розміри зон затримки росту, які створюють уявлення про високу чутливість штамів. І, навпаки, розмір зон різко знижується при збільшенні щільності інокулюму. Вирішальне значення має його величина при визначенні чутливості до бета-лактамних антибіотиків метицилінорезистентних варіантів стафілококів внаслідок гетерогенності їх саме за показником чутливості. Для виявлення стійкості до метициліну необхідно дотриму­ватись певних температурних режимів (30-35 °С). Оскільки ці стафілококи повільніше ростуть при 37 °С, слід їх культивувати на середовищах з додаванням 5 % хлориду натрію. Результати враховують через 24 та 48 год. Для контролю стандартності проведення досліджень у кожному досліді використовують тест-культури з відомою чутливістю до антибіотиків. ВООЗ рекомендує три штами типових культур: Escherichia coli, Staphy­lococcus aureus, Pseudo­monas aeruginosa. При визначенні антибіотикочутливості виділених штамів слід співставляти отримані дані з розмірами зон пригнічення росту навколо дисків з антибіотиками для контрольних культур (табл. 12). Їх порівнюють з допустимими контрольними значеннями.

Якщо діаметри зон пригнічення росту контрольних штамів знаходяться у певних межах, це свідчить про достатню стандартизацію і точність проведених експериментів. Не слід розміщати на чашці Петрі понад 6 дисків, так як при великих діаметрах зон затримки росту це може бути джерелом помилок і впливати на кількісну інтерпретацію результатів. Правильний підбір набору дисків є фактором, який визначає коректність досліджень і, без сумніву, інтерпретацію результатів. Орієнтовні дані щодо вибору наборів дисків із врахуванням виду виділеного збудника і локалізації інфекції наведено у таблиці 13.

Оцінку результатів проводять за таблицею 14, яка містить граничні значення діаметрів зон затримки росту для резистентних, помірно резистентних та чутливих штамів, а також значення мінімальної пригнічуючої (інгібуючої) концентрації (МПК, МІК) антибіотиків для стійких і чутливих штамів.

Одержані значення діаметрів зон затримки росту порівнюють з контрольними значеннями таблиці 14 і відносять досліджувані штами до однієї з трьох категорій чутливості.

 

Метод дифузії за допомогою дисків є якісним методом. Він дозволяє встановити лише факт чутливості або резистентності збудників інфекції. Однак встановлений корелятивний зв’язок розмірів зон пригнічення росту досліджуваних штамів і значень МІК (мінімальна концентрація препарату, яка інгібує ріст дослі­джуваного штаму) антибіотиків дозволяє оцінити ступінь чутливості і кількісно, використовуючи дані, наведені у спеціальних таблицях. За своїм ступенем чутливості до антибіотиків мікроорганізми поділяються на три групи:

1 група – чутливі до антибіотиків (збудники знищуються в організмі при використанні звичайних терапевтичних доз препаратів);

2 група – помірно-резистентні (для них лікувальний ефект може бути досягнутий при використанні максимальних терапевтичних доз препаратів);

3 група – резистентні (бактерицидних концентрацій препаратів в організмі створити неможливо, тому що вони будуть токсичними).

 

Граничні межі діаметрів зон затримки росту еталонних штамів

 

Основні набори дисків, які рекомендуються для визначення чутливості
залежно від виду виділеної культури та патологічного матеріалу

Граничні значення діаметрів зон затримки росту і значення МПК антибіотиків

                                                                               для інтерпретації результатів

 

При визначенні стійкості до антибіотиків, близьких за хімічною будовою і спектром антибактеріальної дії, можливе використання клас-диска, просякнутого одним з антибіотиків певної групи. Так, за допомогою диска з бензилпеніциліном можна визначати чутливість до біцилінів, феноксиметилпеніциліну; цефалексиновим – до цефазоліну, цефаклору, цефалотину. Однак, не рекомендується використовувати тетрациклінові диски для визначення чутливості до доксицикліну.

Строки та температура зберігання дисків вказані на етикетці упаковок. Диски з малостабільними антибіотиками (бензилпеніциліном, ампіциліном, карбеніциліном, метициліном, оксациліном) слід зберігати при 4 °С або 14 °С. Після того, як флакон із дисками відкрито, його зберігають протягом тижня при 4 °С. Перед застосуванням його протягом 1 год залишають при кімнатній температурі для попередження утворення конденсату на внутрішніх стінках флакона. Диски із простроченим терміном зберігання, де сілікагель має рожевий колір, використовувати не можна.

 

Метод серійних розведень. Показаннями для визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень є необхідність одержання кількісних даних (переважно при тяжкому перебігу інфекційних процесів) для проведення регульо­ваної антибіотикотерапії.

Встановлення ступеня чутливості мікробів до антибактеріальних препаратів впливає на вибір антибіотика (наприклад, відмова від ліків з високою токсичністю при помірному ступені чутливості збудника до них), його дозування (концентрація антибіотика в крові повинна в 2-3 рази перевищувати його мінімальну пригнічуючу концентрацію по відношенню до збудника) і режим введення. Крім того, її кількісне визначення необхідне також для встановлення бактерицидної дії обраного препарату (як гарантії швидкого терапевтичного ефекту та безрецидивного перебігу) по відношенню до даного збудника.

Існують дві модифікації методу серійних розведень – визначення чутливості на рідкому та густому живильних середовищах. Метод дає можливість визначити МПК препарату для виділеного штаму збудника.

Для визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень у рідкому живильному середовищі готують ряд (8-10 і більше) пробірок з двократними послідовними розведеннями препарату.

Визначення чутливості за методом серійних розведень

Середовище попередньо розливають у пробірки по 2 мл. У першу додають 2 мл розчину антибіотика певної концентрації, перемішують і переносять до наступної пробірки, продовжуючи розведення до передостанньої, з якої видаляють 2 мл суміші. Остання пробірка служить контролем росту культури. У тому ж бульйоні, який використовують для розведення антибіотиків, готують суспензію добової агарової або бульйонної культури бактерій з розрахунку 105-106 мікробних тіл в 1 мл залежно від виду збудника. Потім до кожної пробірки з розведеннями, а також до контрольної додають по 0,2 мл виготовленої суспензії. При визначенні чутливості до пеніцилінів пеніциліназоутворюючих стафілококів рекомендують використовувати одночасно велике й мале мікробне навантаження (100, 100000 та вище мікробних тіл в 1 мл). Залежно від величини посівної дози значення МПК препарату може коливатись: при збільшенні дози чутливість знижується за рахунок зростання кількості пеніцилінази, що утворюється в середовищі.

Пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год. Результати враховують, визначаючи наявність або відсутність росту в середовищі з різними розведеннями препарату. Остання пробірка, в якій спостерігають затримку росту культури (прозорий бульйон), відповідає МПК (мінімальній пригнічуючій концентрації) або МБсК (мінімальній бактеріостатичній концентрації) препарату відносно даного мікроба і вказує на ступінь його чутливості. Якщо ознаки росту з’являються в усіх пробірках, досліджуваний штам резистентий до максимальної концентрації препарату, яку було взято у дослід. Відсутність росту бактерій в усіх пробірках, крім контрольної, свідчить, що МПК препарату нижча, ніж та, що використовується в досліді.

Для визначення бактерицидного ефекту антибіотика з декількох останніх пробірок, в яких немає ознак росту, роблять висів на сектори агару в чашках Петрі. Через 24-48 год інкубації при оптимальній температурі відмічають ту найменшу концентрацію препарату в пробірці, посів з якої не дав росту. Її вважають мінімальною бактерицидною концентрацією (МБцК).

 

 

 

Принцип методу серійних розведень у густому живильному середовищі анало­гічний попередньому. Для цього готують серію розведень антибіотика в агарі, додаючи один об’єм, який містить певну кількість препарату до 9 об’ємів агару. Для цього зручно розлити агар у флакони або широкі пробірки по 13,5 мл. Перед постановкою агар розплавляють на водяній бані і після охолодження до 60-65 °С у кожну пробірку додають 1,5 мл відповідного розведення антибіотика (в бульйо­ні), ретельно перемішують і виливають у чашку Петрі. У контрольну пробірку з агаром замість розчину антибіотика вносять 1,5 мл дистильованої води. Чашку поділяють на сектори, на кожний з яких засівають досліджуваний штам. Посіви роблять бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою. Для посіву зручно використати спеціальний штамп-реплікатор, який дозволяє нанести одночасно на поверхню агару 25-50 досліджуваних культур. Результати враховують після 18-24 год інкубації в термостаті при оптимальній температурі. За МПК антибіотика для даного штаму приймають ту, при якій відсутні ознаки росту колоній на поверхні агару (або замість бляшки є ріст поодиноких колоній).

З двох способів визначення антибіотикочутливості мікробів до антибіотиків (розведень у густому та рідкому середовищах) більш точним є метод серійних розведень у рідкому середовищі. Результати, які одержують за допомогою розведень в агарі, менш постійні. Метод не слід застосовувати при оцінці чутливості тих мікробів, які дають тонкий, розріджений ріст на поверхні чашки (стрептококи, пневмококи) або, навпаки, мають тенденцію до повзучого росту (протей).

Недоліком методів серійних розведень є їх висока трудоємність, що обмежує використання в звичайних бактеріологічних лабораторіях. З метою спрощення було запропоновано модифікацію методу із заміною ряду з 10 пробірок, що містять різні кількості препарату, трьома концентраціями антибіотика. Перша з них відповідає максимальній, що знаходиться у крові при введенні терапевтичних доз, друга – рівню, що спостерігається через Т1/2 (час зниження концентрації антибіотика на 50 %). Третя є мінімальною, тобто тою, яка дорівнює МПК для високочутливих штамів. У відповідності до використаних концентрацій антибіотиків досліджувані штами можна віднести за рівнем чутливості до трьох основних груп: резистентні (МПК для яких перевищує значення максимальної концентрації антибіотика у крові), помірно чутливі (значення МПК наближаються до максимальної або середньої концентрації) і високочутливі (чутливість яких до антибіотика знаходиться на рівні мінімальної концентрації, що використовується у досліді). Такими концентраціями при визначенні чутливості до бензилпеніциліну є відповідно 0,05-0,2, 0,5 і 2,0 ОД/мл, до макролідів – 0,1, 0,5-1,0 і 4,0 мкг/мл, до аміноглікозидів – 0,5-1,0, 6,0-8,0 і 15,0-20,0 мкг/мл.

 

Прискорені методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків. Використовуючи звичайні методи, відповідь може бути отримана через 18-20 год від початку дослідження, не враховуючи етапів виділення чистої культури. Це призводить до того, що у більшості випадків особливо при затяжному та тяжкому перебігу хвороби, лікування антибіотиками починають задовго до одержання даних лабораторного обстеження. Залежно від принципів, на яких вони базуються, прискорені методи передбачають:

• визначення змін ферментативної активності мікроорганізмів під впливом антибіотиків;

• визначення кольору редокс-індикаторів при зміні окисно-відновного потенціалу під час росту бактерій у живильному середовищі;

• цитологічну оцінку змін морфології бактеріальних клітин під впливом антибіотиків.

До першої групи належить метод Роджерса, орієнтований на здатність антибіотиків пригнічувати ферментативну активність чутливих мікроорганізмів, що супроводжується зміною кольору відповідного індикатора. Суть його полягає у диференційованій зміні червоного кольору фенолового червоного на жовтий або фіолетовий залежно від чутливості досліджуваного штаму. У випадку чутливості до дії антибіотика не відбувається розкладання глюкози при культивуванні у середовищі, яке містить її та певні концентрації препарату. При цьому середовище забарвлюється у фіолетовий колір внаслідок зсуву рН у лужну сторону. Зміна червоного кольору на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кислоти внаслідок росту штаму, резистентного до дії антибіотика. Якщо до середовища додати 0,25 % дріжджового екстракту, результати можуть бути врахованими вже через 2-2,5 год від початку дослідження.

Наступна група методів реєструє зміни окисно-відновного потенціалу середовища в процесі росту мікроорганізмів, про що свідчить зміна кольору резазурину, 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу та інших, які додаються до середовища. Цей метод технічно простий, а результати одержують через 2-6 год. Принцип його зводиться до того, що розтоплений та охолоджений до 50 °С агар засівають досліджуваною культурою бактерій із розрахунку 200 млн. мікробних тіл, а на поверхню накладають диски з антибіотиками. Чашки інкубують при оптимальній температурі протягом 3-5 год, потім обробляють індикатором і повторно інкубують при 37 °С протягом 20-30 хв. Результати враховують за зміною кольору навколо дисків з антибіотиками. Якщо використовують 1 % розчин 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, ділянки агару з бактеріальним ростом внаслідок утворення формазану набувають червоного кольору, а зони пригнічення росту навколо дисків залишаються безбарвними.

Судити про ступінь чутливості мікробів до антибіотиків можна з такою ж точністю, як і за допомогою стандартного методу дисків, проте час дослідження зменшується до 3-5 год.

Утворення інволюційних форм бактерій під впливом антибіотиків досліджують під фазово-контрастним чи антоптральним мікроскопом у спеціальних мікрокапсулах. Вони утворюються внаслідок дії бактеріостатичних концентрацій препарату. Під впливом суббактеріостатичних концентрацій, а також при резистентності досліджуваного штаму на поверхні агару виростають нормальні мікроколонії.

Метод може бути застосований для визначення чутливості штамів кишкової палички, стафілококів, холерних вібріонів. Отримані дані у більшості випадків збігаються з тими, які дають класичні методи.

За останні роки розроблено численні модифікації методу серійних розведень у живильних бульйонах. Зокрема, експрес-методи з титруванням антибіотика в об’ємі 0,25 мл.

Випускаються комерційні набори тривалого зберігання, які складаються з планшетів з ліофільно висушеними розведеннями антибіотика, куди вноситься по 0,1 мл суспензії чистої культури мікроорганізмів. Результати визначення антибіотикочутливості можна оцінювати візуально (при наявності у середовищі індикатора) або за допомогою спектрофотометрів, коли реєструється зміна оптичної густини середовища.

Визначати чутливість бактерій до антибіотиків можна й за допомогою автома­тизованих мікробіологічних систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2, Sceptor та ін.). При їх використанні результати отримують вже через 3-10 год. Одна з їх переваг полягає в тому, що вони дозволяють отримувати результати одночасно до 18-20 антибіотиків. Ці методи широко використовують у мікробіологічних лабораторіях, вони добре корелюють з іншими методиками і за їх допомогою можна не тільки вибирати раціональну схему антибіотикотерапії, але й проводити епідеміологічний контроль резистентності.

Однак при користуванні такими автоматизованими системами частота виявлення резистентних штамів може бути знижена внаслідок повільного росту стійких варіантів. У більшості подібних систем результати враховують шляхом порівняння росту (або загибелі) бактеріальних клітин у присутності антибіотиків з контролем, де є тільки мікроби. За цих умов досить важко диференціювати клітини, які гинуть, від тих, що повільно розмножуються.

До інших факторів, які впливають на результати, належить дія субінгібіторних концентрацій препаратів на ультраструктуру бактеріальних клітин. Вони призводять до зміни форми, набухання клітин, що може супроводжуватись зміною оптичної густини суспензії та спотворенням результатів. В свою чергу, це дає неправильну інформацію про чутливість збудників.

Таким чином, застосування будь-якого методу дозволяє визначити антибіотикограму збудника – спектр його чутливості та антибіотикостійкості.

Усі методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків мають свої перева­ги і свої недоліки. Тому постійний контроль за об’єктивністю результатів і дотри­ман­ням правил проведення досліджень сприяють одержанню достовірних даних.

У більшості випадків результати визначення антибіотикостійкості in vitro збігаються з клінічними наслідками антибіотикотерапії. Випадки розбіжності пояснюються рядом причин, серед яких найчастіше зустрічається помилкове трактування одержаних лабораторних даних.

Причиною таких ситуацій може бути використання при посіві не чистої культури бактерій, а патологічного матеріалу. Тому визначається не чутливість інфекційного агента, а мікробної асоціації, в тому числі й сапрофітної флори. Помилки зустрічаються при дослідженні вмісту дванадцятипалої кишки, фекалій, харкотиння, виділень з ран, сечі тощо.

Плазміди роблять бактерії нечутливими до переважної більшості антибіотиків, які використовуються у клініках, оскільки кодують синтез ферментів, що руйнують препарати. Одним з найдослідженіших ферментів є бета-лактамаза, яка руйнує антибіотики, що належать до групи бета-лактамів. Розроблено декілька методичних прийомів, що дозволяють швидко визначити її активність. Один з них полягає в тому, що на фільтрувальний папір розміром 2´2 см, що знаходиться в чашці Петрі, капають одну краплю 2 % водного розчину крохмалю. Потім на цей папір наносять петлею агарову культуру мікробів і розтирають її, формуючи бляшку діаметром до 5 мм. На її поверхню наносять робочий йодний розчин пеніциліну.

Облік результатів проводять через 10 хв інкубації системи при кімнатній темпе­­ра­турі. При наявності бета-лактамази на темно-синьому фоні спостерігається яскра­во виражена чітка зона просвітління навколо бляшки, що містить агарову культуру мікробів. При негативному результаті зона просвітління відсутня, а краї бляшки нечіткі.

Визначення концентрації антибіотиків у біологічних рідинах. При тяжких інфекційних процесах, наприклад, сепсисі інколи доводиться визначати концентрацію антибіотиків у біологічних рідинах, зокрема, сироватці крові, сечі. Для цього використовують метод серійних розведень (табл. 16) на рідкому середовищі з глюкозою та індикатором Андреде. У двох паралельних рядах готують серійні розведення сироватки і стандарту антибіотика. Потім до кожної пробірки, включаючи контрольні, додають стандартну суспензію тест-мікробів. Пробірки інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18 год. У тих пробірках, де концентрація антибіотика пригнічує мікроби, середовище залишається безбарвним і прозорим. Якщо мікроорганізми проростають, про це свідчить помутніння середовища і поява рожевого забарвлення.

Можна використати також фенол-сироваткове середовище з індикатором фено­ловим червоним. У цьому випадку при відсутності росту мікроорганізмів сере­до­вище залишається червоним, а при наявності ознак росту стає мутним і набуває жовтого кольору.

Виходячи із даних таблиці, розчин стандарту пеніциліну затримує ріст тест-мік­ро­бів у концентрації 0,025 ОД/мл, а досліджувана сироватка – в розведенні 1:8. Отже, вміст пеніциліну в сироватці крові буде дорівнювати 0,2 ОД/мл (0,025 ОД/мл´8).

 

Визначення концентрації пеніциліну в сироватці крові

 

 

    

 

 

Матеріали підготувала доц. Романюк Л.Б.